《Environmental Science & Technology》：DURABLE: A Workflow for Determining Corrosion-Driving and Protective Microbial Mechanisms
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微生物影响腐蚀（microbiologically influenced corrosion, MIC）威胁着全球基础设施，每年造成数十亿美元的损失。其持续存在源于未解决的机制——特别是微生物产生的驱动或抑制腐蚀的代谢产物——以及微生物群落结构。由于缺乏能够快
微生物影响腐蚀（microbiologically influenced corrosion, MIC）威胁着全球基础设施，每年造成数十亿美元的损失。其持续存在源于未解决的机制——特别是微生物产生的驱动或抑制腐蚀的代谢产物——以及微生物群落结构。由于缺乏能够快速准确识别MIC相关微生物及其功能的系统性工作流程，相关进展受到阻碍。在此，研究人员提出了DURABLE（实验室环境中独特腐蚀抗性或加速生物制剂的检测），这是一个将高通量微生物筛选与基因组学和代谢组学工作流程相结合的流程。研究人员将DURABLE工作流程应用于六个柴油储罐样本，揭示了燃料依赖性的微生物群落结构，细菌群落的多样性和均匀度均高于真菌群落。该工作流程使用碳钢珠快速筛选了80多个细菌分离株的腐蚀活性，将检测时间从传统的30天金属挂片试验缩短至约2天。超过40个分离株被鉴定为具有腐蚀性。进一步使用质谱分析揭示了腐蚀相关代谢产物，并通过电化学分析进行了验证。因此，DURABLE实现了约15倍的筛选速度提升，并为解析MIC动态提供了一个可扩展的机制框架。研究人员预计这一进展将推动碳氢燃料基础设施中精准缓解策略的开发。
**DURABLE工作流程：解析燃料储罐中微生物腐蚀驱动与防护机制的研究**
**一、研究背景与问题**
微生物影响腐蚀（microbiologically influenced corrosion, MIC）是石油天然气、废水处理、基础设施、海洋、食品和国防等行业面临的重大且代价高昂的问题。在石油天然气行业中，燃料储罐腐蚀每年导致数十亿美元损失。传统MIC评估方法包括目视检查、腐蚀产物分析和金属挂片腐蚀速率测量，而基于DNA分析结合电化学技术的先进方法可识别与MIC相关的微生物。然而，现有方法存在几个主要不足：第一，缺乏用于MIC相关微生物表型筛选和分离的综合高通量系统，现有方法劳动密集、耗时且机制洞察有限；第二，缺乏将微生物群落组成、个体微生物功能和代谢谱与腐蚀联系起来的综合分析框架。尽管已知MIC源于微生物代谢产物驱动的化学和电化学过程，但这些要素很少被综合统一地研究。大多数研究集中于表征微生物群落组成、富集培养物或分离菌株，通常使用测序深度有限的扩增子测序，对个体微生物的表征甚少。燃料储罐中MIC的许多方面仍待解决：燃料类型和储罐内空间位置对微生物群落的影响尚不清楚；储罐微生物在促进或抑制MIC中的作用在很大程度上未知；实验室研究与实际观察之间存在显著脱节。为此，研究人员开发了DURABLE（实验室环境中独特腐蚀抗性或加速生物制剂的检测）这一综合流程，将高通量微生物筛选与基因组学和代谢组学工作流程相结合，以加速MIC机制表征。
**二、研究内容与结论**
研究人员将DURABLE工作流程应用于六个柴油储罐样本，揭示了燃料依赖性的微生物群落结构，利用碳钢珠快速筛选了80多个细菌分离株的腐蚀活性，超过40个分离株被鉴定为具有腐蚀性，并通过质谱分析和电化学分析鉴定和验证了关键腐蚀驱动及保护性代谢产物，实现了约15倍的筛选速度提升，为解析MIC动态提供了可扩展的机制框架。
**三、关键技术方法**
研究采用了以下主要技术方法：①基于16S rRNA和ITS扩增子测序的微生物群落组成、α多样性和β多样性分析；②基于琼脂糖凝胶液滴微流控的单细胞包埋培养与细菌分离方法；③基于碳钢（carbon steel, CS）珠的96孔板高通量腐蚀表型比色筛选；④碳钢挂片失重腐蚀速率测定及铁离子浓度分析；⑤全基因组测序与基于全长16S rRNA序列的系统发育分析；⑥基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRAM）的非靶向代谢组学分析；⑦基于标准品的电化学极化曲线验证实验。样本来源为美国海军研究实验室（密西西比州斯坦尼斯航天中心）两座模拟燃料储罐（分别储存加氢处理可再生柴油HRD和石油基海军F76柴油）中的六个不同位置样本。
**四、研究结果**
**（一）DURABLE工作流程的建立**：该流程系统整合了微生物群落分析、细菌分离、分子表征、腐蚀表型筛选、代谢物鉴定和电化学验证等步骤，实现了从群落到菌株再到代谢产物的全链条MIC机制解析。
**（二）燃料类型与位置依赖性细菌群落结构**：通过16S rRNA扩增子测序分析发现，HRD罐和F76罐的物种丰富度相似，但HRD罐的Shannon指数显著更高，表明群落均匀度更高。β多样性分析显示样本按储罐类型清晰分离。变形菌门为所有样本中的优势菌门。属水平上，HRD罐的优势属包括Reyranella（17.3%）、Xanthobacter（14.3%）、Bradyrhizobium（6.3%）等，F76罐的优势属为Xanthobacter（25.2%）、Sphingomonas（14.71%）和Skermanella（9.1%），表明燃料类型强烈影响微生物群落组成。
**（三）真菌群落组成**：ITS扩增子测序结果显示，真菌多样性低于细菌多样性。子囊菌门为优势菌门。HRD罐的优势属包括Purpureocillium（18.0%）、Curvularia（6.3%）和Ochroconis（4.2%），F76罐的优势属为Fusarium（42.5%）和Cladosporium（33.8%）。样品未按储罐类型聚类，表明真菌群落受空间位置影响较大。
**（四）基于CS珠的快速腐蚀表型筛选**：利用96孔板碳钢珠比色法对84个细菌分离株进行腐蚀表型筛选，腐蚀活性菌株在第二天即出现培养基褐色变色，镜检确认锈迹形成，比传统30天金属挂片试验快约15倍。其中42个分离株被鉴定为具有腐蚀性，42个为非腐蚀性。
**（五）CS挂片腐蚀速率评估**：在ASW/柴油/空气条件下，腐蚀菌株F32-44的腐蚀速率与非接种对照无显著差异但显著高于非腐蚀菌株；在R2A水相条件下，F32-44的腐蚀速率显著高于所有其他组。铁离子浓度变化趋势与腐蚀速率一致，证实了可溶性铁浓度可作为腐蚀表型评估的可靠指标。
**（六）代表性菌株的鉴定与形态特征**：全基因组测序和系统发育分析表明，腐蚀菌株F32-44与Cellulosimicrobium cellulans亲近，非腐蚀菌株F50-8与Acinetobacter lwoffii亲近，F32-40与Microbacterium proteolyticum亲近。F50-8携带七拷贝16S rRNA基因，提示潜在更高的生长速率。
**（七）基因组中的燃料降解和生物膜形成相关基因**：所有菌株均含醇脱氢酶和醛脱氢酶基因，而烷烃单加氧酶基因仅存在于Acinetobacter F50-8中。在芳香烃降解方面，Microbacterium F32-40携带全部四种环裂解途径基因，F50-8具有两种邻位裂解基因，F32-44仅含儿茶酚间位裂解基因，体现了功能多样性和潜在互补性。在胞外聚合物（EPS）合成和菌毛组装基因方面，各菌株也存在显著差异，F50-8独有IV型菌毛生物合成基因。
**（八）基于燃料的细菌生长和生物膜形成**：菌株能以HRD或含10% HRD的柴油共混物为碳源生长，代谢物分析检测到TCA循环中间体、脂肪酸β-氧化产物和呋喃化合物降解中间体等显著变化，证实了活跃的燃料代谢。碳钢挂片上的生物膜形成与生物膜相关基因的存在相一致。
**（九）水相酸化和关键代谢产物鉴定**：腐蚀菌株F32-44使R2A培养液pH降至约5，显著低于非腐蚀菌株和对照（约8.2），提示有机酸产生通过降低局部pH加速金属溶解。比较代谢组学分析共检测到477种代谢物，按积累模式分类：腐蚀菌株特有6种、两类型菌株中均有但腐蚀菌株中更高4种、非腐蚀菌株特有11种、非腐蚀菌株中更高4种。其中甲磺酸（MSA）是已知强有机酸，具有文献记载的腐蚀性。
**（十）关键代谢产物的电化学验证**：电化学分析证实MSA和N-甲基己内酰胺在R2A中呈浓度依赖性增加腐蚀电流密度（I
corr），为腐蚀加速剂；而3-甲基腺嘌呤、烟酸、吲哚-3-乙酸和次黄嘌呤在0.5 M HCl中随浓度增加同时降低阴、阳极I
corr并增加表面覆盖率（η），为酸性条件下的有效腐蚀抑制剂。扫描电镜（SEM）分析进一步验证：暴露于MSA或N-甲基己内酰胺的碳钢表面出现显著粗糙度和沉积物，而添加四种保护性化合物则显著减少了表面损伤。
**五、讨论与结论**
DURABLE是一个系统化流程，能够从燃料储罐生物膜中快速分离细菌并进行腐蚀表型筛选，同时鉴定与MIC相关的关键代谢产物。研究发现燃料储罐中的微生物群落随燃料类型和空间尺度变化。研究人员首次从燃料储罐中直接分离出Microbacterium和Cellulosimicrobium菌株，以及首株A. lwoffii储罐分离株，证明了琼脂糖凝胶液滴微流控系统在分离微生物群落中细菌菌株的有效性。96孔板碳钢珠试验与代谢物谱分析相结合，为快速鉴定MIC相关代谢产物提供了有力策略。值得注意的是，保护性化合物次黄嘌呤也在腐蚀菌株F32-44中积累，但水平低于非腐蚀菌株，表明总体腐蚀性由优势代谢物谱决定而非单一化合物。研究同时鉴定出腐蚀性和保护性代谢产物，为微生物在促进或抑制腐蚀中的双重作用提供了直接证据。本工作建立了DURABLE作为表征MIC的综合流程，将微生物群落结构、个体菌株功能与代谢产物联系起来，为解析MIC动态提供了可扩展的机制框架。研究结论表明，DURABLE能够加速MIC相关微生物及其功能的识别，有望推动碳氢燃料基础设施中精准腐蚀缓解策略的开发，并为未来利用微生物菌群（尤其是细菌-真菌联合体）深入研究MIC机制和开发靶向腐蚀控制策略奠定了基础。
