尼曼-匹克病C1型疾病中嗅觉系统的神经退行性变

《iScience》：Neurodegeneration in the olfactory system in Niemann Pick type C1 disease

　　

尼曼-匹克病C1型（NPC1）是一种罕见的神经退行性疾病，与胆固醇生物合成缺陷相关。由于嗅觉功能障碍常先于神经退行性疾病的临床表现出现，研究人员探究了嗅觉系统是否可为NPC1疾病进程提供早期洞察。利用携带人I1061T突变（I1061T mutation）的敲入小鼠模型，研究人员在出生后36天和60天分析了野生型、杂合子（heterozygous，HET）和突变型（mutant，MUT）小鼠的嗅觉上皮（olfactory epithelium，OE），以评估神经退行性变。突变型小鼠表现出成熟嗅感觉神经元（olfactory sensory neurons，OSNs）密度降低、凋亡增加以及巨噬细胞/小胶质细胞（macrophage/microglia）浸润。这些结构改变伴随气味诱发反应减弱和气化引导行为受损。最后，研究人员评估了一个携带双等位基因NPC1突变的孩子及其两位杂合子携带者父母组成的家庭的嗅觉功能，发现三人都存在不同严重程度的嗅觉减退（hyposmia）。研究人员的工作从结构和功能上全面表征了OE，提出将其作为监测疾病进展的哨兵（sentinel）。

**论文解读：尼曼-匹克病C1型疾病中嗅觉系统的早期神经退行性变**

**研究背景与问题**
尼曼-匹克病C1型（NPC1）是一种由NPC1基因（95%患者）或NPC2基因突变引起的常染色体隐性遗传神经退行性疾病。NPC1糖蛋白参与低密度脂蛋白（LDL）来源的未酯化胆固醇从晚期内体/溶酶体向其他细胞区室的输出；功能缺失突变导致脂质转运缺陷、胆固醇生物合成调控异常，以及未酯化胆固醇和神经节苷脂GM2、GM3在晚期内体/溶酶体中积累，尤其在肝脏、脾脏、肺和脑等组织中。最常见的突变I1061T占人类等位基因的15%–20%，导致NPC1蛋白错误折叠并进入内质网相关降解途径，引发经典幼年型临床表现，包括肝脾肿大、共济失调、肌张力障碍和进行性神经退行性变。然而，除视网膜变性外，NPC1疾病中感觉系统（如嗅觉、三叉神经、听觉通路）的研究尚属空白。在帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，嗅觉功能障碍常先于运动或认知症状出现，提示嗅觉系统可能成为早期疾病指标的敏感窗口。因此，研究人员提出假设：在NPC1疾病中，嗅觉系统（尤其是嗅觉上皮，OE）可能发生结构性和功能性改变，并可作为疾病进展的早期哨兵。

**研究内容与结论**
研究人员利用携带人I1061T突变的Npc1^I1061T敲入小鼠模型，在出生后第36天（P36，症状前期）和第60天（P60，症状期）系统分析了野生型（WT）、杂合子（HET）和突变型（MUT）小鼠的OE。通过免疫荧光、电嗅觉图（EOG）记录、行为学测试及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）脂质分析，发现MUT小鼠在P36时就已出现成熟OSN密度显著降低、凋亡细胞增加、小胶质细胞/巨噬细胞浸润及浸润细胞形态改变，伴随气味诱发EOG反应幅度下降和气味引导食物寻找行为潜伏期延长。脂质组学分析显示，MUT小鼠在P60时OE中溶血磷脂酰胆碱（LPC）16:0显著升高，磷脂酰胆碱/溶血磷脂酰胆碱（PC/LPC）比值降低，提示炎症状态。此外，研究人员还对一个携带双等位基因NPC1突变的孩子及其杂合子父母进行了Sniffin’ Sticks嗅觉测试，发现三人都表现出不同程度的嗅觉减退（TDI评分分别为19.5、26.25和30.5，均低于嗅觉减退阈值30.75），且阈值测试得分较低，提示外周性损伤。该研究首次在NPC1疾病中揭示了OE的早期退化特征，并提出嗅觉功能可作为监测疾病进展的哨兵，论文发表在《iScience》。

**关键技术方法**
1. **免疫荧光与细胞定量**：使用抗OMP（成熟OSN标志物）、抗Tuj1（神经元标志物）、抗cCasp3（激活型caspase-3，凋亡标志物）、抗Iba1（小胶质细胞/巨噬细胞标志物）、抗CK14（水平基底细胞标志物）和抗Ki67（增殖细胞标志物）抗体，对OE冠状切片进行染色，并在共聚焦显微镜下定量细胞密度和OE厚度。
2. **电嗅觉图（EOG）记录**：在离体半脑标本上，于空气相中用乙酸异戊酯（IAA）以不同浓度（10^-7至10^-1 M）刺激OE，记录诱发电位，分析反应幅度和剂量-反应关系。
3. **气味引导食物寻找测试**：将小鼠禁食过夜后，在新鲜垫料中埋藏饼干，记录小鼠找到饼干所需时间，以评估嗅觉驱动行为。
4. **MALDI-TOF/MS脂质分析**：从OE分离脂质，采用快速脂质提取法，在正离子模式下分析磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）种类，计算PC/LPC比值。
5. **人体嗅觉评估**：使用Sniffin’ Sticks测试（阈值、辨别、识别三部分）对一名NPC1患者及其杂合子父母进行嗅觉功能评估，并与Oleszkiewicz等（2019）的常模数据比较。
（样本队列来源：小鼠模型B6.129-Npc1^{tm(I1061T)Dso}购自Jackson Laboratory；人类参与者来自意大利巴里一家三口，经伦理委员会批准。）

**研究结果**

**1. NPC1突变小鼠表现出早期神经退行性变**
通过免疫荧光染色，研究人员在P36和P60时均发现MUT小鼠OE中OMP⁺成熟OSN密度显著低于WT小鼠（P36：p=0.027；P60：p=3.25×10^-19），而Tuj1⁺/OMP^-未成熟OSN密度在各基因型间无显著差异。OE厚度在MUT小鼠中呈减小趋势，但未达统计学显著性。这表明成熟OSN的减少源于神经元死亡，而非新生不足。

**2. OSN在神经退行性变过程中经历凋亡**
使用cCasp3抗体检测凋亡细胞，发现MUT小鼠在P36时cCasp3⁺细胞密度显著高于WT（p=0.04），在P60时HET和MUT小鼠均显著高于WT（p=0.002）。凋亡增加解释了成熟OSN密度的降低。

**3. NPC1突变小鼠OE中表现出神经炎症**
Iba1免疫组化显示，MUT和HET小鼠OE中Iba1⁺小胶质细胞/巨噬细胞数量增加，且细胞形态由分支状变为阿米巴样肥大形态，提示激活与浸润。在WT小鼠中，Iba1⁺细胞主要位于基底层下方，而HET和MUT小鼠中则侵入上皮层。

**4. NPC1 MUT小鼠OE中磷脂谱改变**
MALDI-TOF/MS脂质分析显示，MUT小鼠在P60时OE中LPC 16:0信号强度显著高于WT（p=0.02），PC 38:4在HET中显著升高，而PC/LPC比值在MUT中显著降低（p=0.03），表明炎症状态。在P36时各组间无显著差异。

**5. 嗅觉上皮的干细胞龛**
使用CK14标记水平基底细胞（HBCs），发现MUT小鼠在P60时HBC密度呈增加趋势但未达统计学意义。Ki67标记增殖细胞（包括球状基底细胞GBCs），各基因型间Ki67⁺基底细胞密度在P36和P60均无显著差异，表明神经发生能力得以保留。

**6. MUT小鼠EOG反应降低**
EOG记录显示，在P36和P60，MUT小鼠对乙酸异戊酯各浓度（10^-7至10^-1 M）的诱发反应幅度均显著低于WT小鼠，剂量-反应曲线整体下移，而HET小鼠反应介于两者之间。线性混合模型分析显示基因型、浓度及交互效应均显著。

**7. MUT小鼠嗅觉驱动行为受损**
在埋藏饼干测试中，MUT小鼠找到饼干所需时间显著长于WT小鼠，在P36和P60均如此。当饼干置于垫料表面时，各组间无差异，排除运动或动机障碍。

**8. NPC1患者及其杂合子父母存在嗅觉减退**
Sniffin’ Sticks测试显示，NPC1患者（21岁）TDI总分为19.5，低于同年龄组第5百分位，属于严重嗅觉减退。母亲（50岁，杂合子）TDI为26.25，低于嗅觉减退阈值30.75；父亲（51岁，杂合子）TDI为30.5，仍低于阈值。三人阈值测试得分均较低，提示外周性损伤。

**总结与讨论**
讨论部分指出，在Npc1^I1061T小鼠模型中，OE的神经退行性变以成熟OSN选择性丢失为特征，而神经发生能力保持相对完整，这与小脑浦肯野细胞等其他脑区的退化模式相似。凋亡主要由细胞自主机制驱动，并可能加剧神经炎症。小胶质细胞/巨噬细胞浸润和激活在MUT和HET小鼠中均明显，但样本量有限，需谨慎解释。EOG和行为学测试结果一致表明，外周嗅觉功能障碍在症状前期即已出现。脂质组学中LPC升高和PC/LPC降低进一步支持炎症状态。人类数据首次报告NPC1患者及杂合子携带者存在嗅觉减退，且阈值测试得分低提示外周损伤，因此OE可作为易获取的哨兵窗口。

**研究结论**
研究人员总结道：在Npc1小鼠模型中，细胞内胆固醇转运异常导致脂质在OE中积累，引起OSN神经退行性变、小胶质细胞激活和凋亡增加，这些变化在疾病早期即出现。细胞水平的改变深刻影响了嗅觉能力，电生理和行为学测试均证实了这一点，后者表型与人NPC1疾病相似。因此，嗅觉丧失可作为早期且易获取的哨兵症状，用于诊断疾病并指导预防/延缓神经退行性变的治疗，同时改善嗅觉功能障碍。此外，杂合子状态也可能改变嗅觉。