《iScience》：Effect of glucocorticoid production by the enteric nervous system on neuronal connectivity is blocked during inflammation in a GR-dependent pathway
编辑推荐：
摘要翻译：糖皮质激素（GC）的肾上腺外合成在维持局部稳态中发挥核心作用。然而，肠神经系统（ENS）——肠道功能的关键调节者——是否能够合成GC，以及这如何影响其功能，此前尚未被探索。在本研究中，研究人员利用大鼠ENS原代培养物，确定局部GC产生是否发生在ENS
摘要翻译：糖皮质激素（GC）的肾上腺外合成在维持局部稳态中发挥核心作用。然而，肠神经系统（ENS）——肠道功能的关键调节者——是否能够合成GC，以及这如何影响其功能，此前尚未被探索。在本研究中，研究人员利用大鼠ENS原代培养物，确定局部GC产生是否发生在ENS内部，并评估其在基础状态和炎症条件下的功能影响。首先，研究人员证明了ENS原代培养物，尤其是肠胶质细胞，通过再生途径从11-脱氢皮质酮（11DHC）产生GC。其次，11DHC处理以糖皮质激素受体（GR）依赖性方式显著增加了与神经元连接性相关的关键分子的表达和密度。最后，炎症阻断了11DHC诱导的连接性分子表达增强，并与pGR-232/pGR-246比值降低相关。本研究表明，ENS局部产生的GC通过GR依赖性机制增强肠道连接性，而这种机制在炎症条件下被消除。
论文解读文章
糖皮质激素（glucocorticoid, GC）是维持生命所必需的类固醇激素，传统上认为其主要由肾上腺皮质束状带合成。近年来研究发现，多种外周组织具有肾上腺外GC合成能力，这种局部产生的GC虽数量远低于肾上腺，却在维持组织特异性稳态中发挥关键作用。在胃肠道中，免疫细胞和肠上皮细胞（intestinal epithelial cells, IECs）已被证实可进行GC的从头合成，且局部GC合成可响应免疫或炎症应激而上调，参与肠道免疫调节。然而，作为肠道功能核心调节者的肠神经系统（enteric nervous system, ENS）是否具备GC合成能力，以及这种局部GC产生对ENS功能的影响，尤其是炎症条件下的变化，此前尚不清楚。已有证据表明GC可调节ENS中参与神经传递和胃肠动力的关键蛋白，但具体机制有待阐明。因此，本研究旨在确定ENS内部是否发生局部GC产生，并评估其在基础状态和炎症条件下对ENS功能的影响。
研究人员采用大鼠ENS原代培养体系，结合纯化的肠神经元和肠胶质细胞培养，运用实时定量PCR（qPCR）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、蛋白质印迹（western blot）和免疫组织化学等技术，系统研究了ENS的GC合成能力及其功能意义。样本来源于Sprague-Dawley大鼠胚胎及成年大鼠结肠组织。研究首先检测了GC合成相关酶的表达，然后通过添加GC前体11-脱氢皮质酮（11-dehydrocorticosterone, 11DHC）评估GC再生能力，并通过GR拮抗剂、11βHsd1选择性抑制剂及炎症因子处理探讨机制。
研究结果分为以下几个部分：
**ENS原代培养能够通过GC再生途径将11DHC转化为皮质酮**：qPCR检测显示，ENS培养物表达Star、Cyp11a1和Cyp11b1等GC合成相关基因，但几乎不表达Bhsd3d1和Cyp21a1，提示其不具备完整的从头合成途径。同时，ENS表达再生酶11βHsd1（由Hsd11b1编码）和失活酶11βHsd2（由Hsd11b2编码）。LC-MS/MS检测证实，在基础条件下ENS培养上清中检测不到皮质酮或11DHC；添加11DHC后，11DHC水平随时间下降，而皮质酮水平逐渐升高，48小时后接近500 nmol/L，证明ENS可通过再生途径将11DHC转化为皮质酮。
**肠胶质细胞是ENS中GC产生的主要贡献者**：纯化的肠神经元中Hsd11b1和Hsd11b2表达较低，且添加11DHC后未检测到皮质酮生成。相比之下，肠胶质细胞中Hsd11b1和Hsd11b2表达较高，且Hsd11b1/Hsd11b2比值增加；将11DHC与肠胶质细胞共孵育可显著产生皮质酮，且时间进程快于ENS原代培养。这表明肠胶质细胞是ENS内GC的主要细胞来源。
**11βHsd1选择性抑制剂减少ENS中11DHC向皮质酮的转化**：使用11βHsd1选择性抑制剂10J处理后，皮质酮产生显著减少，11DHC消耗减慢，证实11βHsd1介导了ENS中的GC再生。
**结肠组织中11DHC/皮质酮比值高于血浆**：在对照大鼠结肠组织中，11DHC浓度为144.2 nmol/mg组织，皮质酮为82.6 nmol/mg组织，活性/非活性激素比值为0.57；而血浆中皮质酮浓度（1263.0 nmol/L）远高于11DHC（116.3 nmol/L），比值为10.9。这表明结肠组织中非活性激素11DHC的可用性较高，可能作为11βHsd1局部转化为皮质酮的前体。
**11βHsd1诱导的ENS原代培养皮质酮产生激活GR并上调GR靶基因**：添加11DHC后，GR靶基因Fkbp5、Sgk1和Tsc22d3的表达显著增加；GR蛋白表达下调，符合GC激活GR后诱导GR自身降解的已知机制；同时pGR-232/GR比值显著升高，表明局部产生的皮质酮具有生物学活性。
**内源性GC以GR依赖性方式诱导ENS原代培养中的神经突生长**：11DHC处理显著上调β-III微管蛋白和突触素-1的表达，并增加nNOS表达。GR拮抗剂CORT108297预处理可阻止这些效应。免疫组织化学定量显示，11DHC使β-III微管蛋白阳性纤维占据的培养面积从9.5%显著增加至11.4%，而神经元总数无变化，表明GC通过GR促进神经纤维密度增加。
**炎症诱导11βHsd1表达增加和11βHsd2表达减少，伴随11DHC向皮质酮转化增强**：用TNF-α和IL-1β处理ENS原代培养物后，Hsd11b1 mRNA和蛋白水平显著升高，Hsd11b2 mRNA水平降低（蛋白水平呈下降趋势）。炎症条件下，11DHC添加后12小时和24小时的皮质酮生成量显著高于对照组，表明炎症增强了ENS的GC再生能力。
**炎症通过降低GR磷酸化阻断11DHC诱导的β-III微管蛋白、突触素-1和nNOS表达**：炎症单独不改变这些蛋白的表达，但在炎症条件下，11DHC不再能上调β-III微管蛋白、突触素-1和nNOS，且纤维密度也无增加。机制研究表明，11DHC单独处理增加pGR-232表达而不改变pGR-246；但在炎症条件下，11DHC同时增加pGR-232和pGR-246，导致pGR-232/pGR-246比值显著降低，提示GR转录活性下降，从而解释了GC促神经突生长作用的丧失。
讨论部分指出，本研究首次证明ENS具有通过再生途径局部合成活性GC的酶学机制，其中肠胶质细胞是主要细胞来源。局部产生的GC通过GR依赖性信号通路促进神经突生长和神经元连接性相关蛋白表达。炎症虽然增强了GC的合成，但同时通过改变GR磷酸化谱（降低pGR-232/pGR-246比值）诱导了ENS对GC的选择性抵抗，使GC的促神经突生长效应消失。这种选择性抵抗可能在急性炎症期间具有适应性意义，因为急性期以神经元损伤为主，再生过程主要在炎症后期激活。研究还观察到炎症条件下GC仍能抑制NF-κB靶基因（如COX-2和ICAM-1）的表达，提示GC的抗炎特性得以保留，进一步支持"选择性"GC抵抗的观点。
研究结论：本研究提供了首个证据，表明ENS拥有功能性酶学机制以实现局部GC合成，这种合成通过自分泌和/或旁分泌机制调节肠道神经突生长；肠胶质细胞是这种局部类固醇生成的主要细胞来源。尽管炎症刺激增强了ENS内的局部GC产生，但同时也消除了基础条件下观察到的神经营养效应，这可能部分归因于炎症诱导的GR磷酸化谱改变。未来需要利用细胞类型特异性遗传模型（如肠胶质特异性基因敲除小鼠）在体内验证这些发现的生理相关性。
