Bulk与单细胞RNA测序分析揭示缺血性脑卒中中DBP相关昼夜节律特征

《iScience》：Bulk and single-cell RNA-seq analyses characterize a DBP-related circadian signature in ischemic stroke

　　

昼夜节律紊乱与缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）预后相关，但昼夜节律基因在卒中病理中的作用仍不清楚。本研究整合患者与小鼠模型的bulk及单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据表征昼夜节律基因表达模式。借助机器学习与一致性聚类，研究人员识别出一个九基因昼夜节律特征，可将卒中患者分层为具有不同免疫浸润谱的三个亚型。单细胞RNA分析突出小胶质细胞为关键介导者，其中DBP（D-box binding PAR bZIP transcription factor）下调与小胶质细胞衰老相关。在小胶质细胞及小鼠卒中模型中操纵DBP显示，恢复DBP可降低衰老表型与梗死体积，同时改善神经功能。这些发现确立了基于昼夜节律基因的患者分层，并提示小胶质细胞DBP作为卒中后损伤的调控因子，为风险评估与靶向干预提供潜在途径。

研究背景：急性缺血性脑卒中起病急骤，再通治疗时间窗窄，致残率、死亡率与复发率高。临床队列提示夜间发病较日间发病3个月功能预后更差，表明昼夜节律（circadian rhythm）参与卒中发生与转归。核心时钟基因经调控神经血管单元（neurovascular unit, NVU）组成细胞的节律影响缺血后病理，但昼夜节律基因尤其是DBP在卒中中的因果与机制尚不明晰，亦缺乏可转化的分型与干预靶点。为此，研究人员整合人外周血bulk RNA-seq与小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型scRNA-seq，构建诊断特征并实验验证DBP-小胶质细胞衰老轴。

主要关键技术方法：研究采用GEO公共数据集GSE16561与GSE58294（人IS外周血PBMC来源）经SVA去除批次效应；以随机森林与SVM-RFE筛选特征，Bootstrap内部验证构建九基因诊断模型；一致性聚类分亚型，WGCNA（weighted gene co-expression network analysis）挖模块，CIBERSORT与MCPcounter估免疫浸润；小鼠MCAO模型scRNA-seq做细胞分型、亚群重组、拟时序（pseudotime）、CellChat细胞互作与SCENIC转录因子调控网络；体内用Iba1启动子AAV2/9特异性恢复小胶质DBP，TTC染梗死体积，免疫荧光共标Iba1/DBP，SA-β-gal染衰老，WB与RT-qPCR检p16^INK4A、p21、γH2AX及SASP（senescence-associated secretory phenotype）。

研究结果：

Integration analysis of two ischemic stroke data and multiple circadian genes were differentially expressed：整合两数据集并ssGSEA评分，证实IS中多数昼夜节律基因异常表达且时钟通路激活。

Expression characteristics of circadian clock genes in patients with IS compared to normal control：差异与相关分析显示HIF1A、PPP1CC、CPT1A、CARM1等与CLOCK显著相关，暗示协同致病。

Machine learning algorithms identified a circadian clock gene model for predicting the occurrence of ischemic stroke：RF+SVM-RFE交集得九基因（NFIL3、DBP、SMARCD3、CRY2、NCOA1、NR3C1、RBM4、HDAC3、PPP1CA），AUC 0.975，Bootstrap稳定，Nomogram可用，且与浸润免疫细胞及炎症基因相关。

Subtype classification of patients with IS based upon circadian genes：一致性聚类将IS分为3亚型，WGCNA棕色/蓝色/绿松石模块分别富集cluster1/2/3，GO显示cluster1肽酶调控、cluster2血管发育、cluster3 p53类DNA损伤应答。

Characteristics of the three clusters identified by consensus analysis developed upon circadian genes：cluster2偏老龄男性、免疫细胞（T细胞、细胞毒淋巴细胞）少；cluster3女性多、免疫活化高；各簇昼夜基因与炎症因子表达异质。

Single-cell RNA-seq analysis reveals the pivotal changes of circadian genes in microglia cells：MCAO小鼠10类细胞中昼夜基因签名下调，以小胶质细胞区分最显著。

Subcluster analysis, pseudotime and transcription factor regulatory network analysis of microglia cells between the sham and MCAO group：小胶质重聚为13亚群，拟时序示sham→MCAO态转变；SCENIC示sham以Foxp1/Lrf7/Klf4为主，MCAO以Egr1/Junb/Fos为主，低签名小胶质互作更强。

Dysregulation of circadian rhythm, especially DBP, in microglia cells might cause the occurrence of ischemic stroke：九基因中DBP在IS与MCAO小胶质中降幅最大，GSEA关联衰老，与Roussel等老化组织DBP下调一致。

Validation of the crucial role of DBP in the mouse MCAO model：MCAO后脑DBP蛋白降低且定位于Iba1⁺小胶质，伴SA-β-gal⁺衰老累积；BV2中敲低DBP升γH2AX、p16^INK4A、p21、SA-β-gal与SASP，过表达逆转阿霉素诱导衰老。

Microglia DBP overexpression protects against ischemic brain injury in the mouse MCAO model：AAV-DBP特异恢复小胶质DBP，减梗死体积、改善神经行为评分、降衰老小胶质比例。

讨论与结论翻译：昼夜节律紊乱参与IS发生与恶化，九基因特征可诊断并分型，DBP下调促小胶质衰老、炎表型与NVU失调，恢复小胶质DBP减轻缺血再灌注损伤。局限在于功能实验在鼠细胞与急性模型完成，需微胶质特异敲除、人源样本与前瞻性多中心队列验证。综上，昼夜节律障碍是卒中防控新靶标，DBP-小胶质衰老轴为风险分层与靶向干预提供潜在路径。论文发表于《iScience》。