白藜芦醇通过BTG2调控的TLR4/MyD88/NF-κB通路，减轻T-2毒素诱导的促炎小胶质细胞活化

《Neuroscience Letters》：Resveratrol attenuates T-2 toxin-induced pro-inflammatory microglial activation via the BTG2-regulated TLR4/MyD88/NF-κB pathway

　　摘要：T-2毒素是一种广泛存在的环境性霉菌毒素，会对人类和动物造成严重的神经毒性危害。神经炎症反应是T-2毒素引发神经毒性的关键机制，但其诱导神经系统炎症反应的分子机制至今尚未完全明确。本研究探讨了B细胞转位基因2（BTG2）在T-2毒素诱导的小胶质细胞活化中的作用，并评估了白藜芦醇的神经保护潜力。体内实验表明，小鼠接触T-2毒素后会出现空间学习与记忆障碍以及运动功能缺陷，这些行为表现伴随海马区和大脑皮层的神经炎症，其特征为小胶质细胞活化及BTG2表达上升。预先给予白藜芦醇可有效逆转这些神经行为缺陷并抑制神经炎症反应。机制分析显示，白藜芦醇能显著减轻T-2毒素引发的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，使用BV-2小胶质细胞进行的体外研究也证实了这一结果。值得注意的是，通过siRNA敲低BTG2同样可以消除T-2毒素诱导的TLR4通路激活及后续的细胞因子表达，从而证明BTG2是该通路的关键上游调控因子。此外，RNA测序进一步证实BTG2可调控免疫反应网络，尤其影响TLR4信号级联反应。综上，这些发现为白藜芦醇可能通过靶向BTG2调控的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥神经保护作用提供了新证据，也为减少因接触T-2毒素带来的环境和健康危害提供了有希望的干预手段。

意义说明：本研究将BTG2重新定义为小胶质细胞神经炎症反应的关键启动因子，同时证实白藜芦醇可通过靶向该通路发挥治疗作用。

引言：T-2毒素被认为是最具危害性的天然真菌代谢物之一，主要由镰刀菌属产生[15]，主要存在于寒冷潮湿地区种植的受污染谷物中，如玉米、小麦、大麦和燕麦，同时也是动物饲料中的常见污染物[7]。人类接触该毒素的主要途径为摄入受污染的谷物产品，或是吸入粉尘或通过皮肤接触[1]、[9]。由于其高脂溶性和稳定性，T-2毒素能够破坏血脑屏障并产生神经毒性效应[38]。有研究显示，小鼠接触T-2毒素会损害血脑屏障的完整性，导致海马区出现严重损伤，表现为神经元排列紊乱、细胞退化、细胞质浓缩以及神经纤维缠结[11]。陈等人还发现，T-2毒素会降低多巴胺水平，引发抑郁样行为，如绝望感和快感缺失[5]。我们在之前的研究中也发现，急性暴露于T-2毒素会导致小鼠的空间学习与记忆能力下降以及运动功能异常[19]。周等人则指出，T-2毒素会在大鼠海马区引发氧化应激，增加神经元凋亡，最终导致神经行为缺陷和海马区结构损伤[42]。作为大脑免疫反应的关键介质，小胶质细胞在抵御中枢神经系统内的真菌病原体方面起着重要作用[17]。T-2毒素引发神经毒性的可能机制包括改变星形胶质细胞和小胶质细胞的活化状态，进而引发神经炎症、血脑屏障功能障碍以及突触功能异常[30]，但T-2毒素介导神经毒性的具体分子驱动因素仍未明确，这限制了针对性治疗手段的开发。

B细胞转位基因2（BTG2），亦称TIS21或PC3，属于BTG/TOB基因家族，是一种重要的抗增殖蛋白[32]。BTG2是一种即刻早期反应基因，能被多种刺激快速激活，在调控细胞的分化、增殖、凋亡以及DNA损伤修复等功能中起关键作用[25]。多项研究表明，BTG2在胃癌[8]、乳腺癌[16]、皮肤癌[10]和卵巢癌[37]等多种癌症中具有肿瘤抑制作用，而其表达下调或丢失则与肿瘤进展及不良预后相关。吴等人在一个大鼠脊髓损伤模型中发现，BTG2受EGR1调控，其转录激活会促进H2O2诱导的神经元凋亡，进而造成神经系统损伤[41]。我们之前的研究提示，BTG2可能在T-2毒素诱导的促炎性小胶质细胞活化过程中起关键中介作用[20]，但在此背景下BTG2调控的下游信号通路尚未得到充分阐明。此外，目前尚无针对上调BTG2以减轻T-2毒素所致脑损伤的药物策略。

白藜芦醇是一种天然多酚，广泛存在于花生、浆果和葡萄中，具有显著的化学预防和治疗效果[6]。它具有多种生物学作用，包括抗肿瘤[33]、抗炎[39]和抗氧化[22]作用，在多种细胞模型中都能提供广泛的保护作用[28]。重要的是，白藜芦醇及其代谢物能够穿过血脑屏障，并在中枢神经系统发挥神经保护作用[34]。例如，在阿尔茨海默病小鼠模型中，持续口服白藜芦醇可减少β-淀粉样蛋白斑块的形成，并改善空间记忆能力[4]。同样，白藜芦醇可通过抑制基质金属蛋白酶-9的活性，减轻缺血小鼠的神经元凋亡和海马区损伤，体现了其在神经毒性中的作用[13]。然而，白藜芦醇能否减轻T-2毒素引发的神经毒性及其背后的分子机制仍需进一步研究。

本研究旨在探究BTG2是否通过TLR4/MyD88/NF-κB信号轴介导T-2毒素诱导的小胶质细胞活化，同时评估白藜芦醇靶向该通路的神经保护潜力。这些发现有望揭示新的理论路径，并为缓解T-2毒素的神经毒性提供有前景的药物治疗方向。

材料与方法：3.1 化学试剂与抗体：T-2毒素（纯度≥99.9%）购自中国山东青岛的普瑞邦生物工程有限公司；白藜芦醇购自中国上海的阿拉丁公司；针对GAPDH的抗体购自中国上海的贝泰姆公司；BTG2抗体购自中国武汉的Proteintech公司；针对TLR4和MyD88的抗体购自中国武汉的Abclonal公司；针对NF-κB p65和IκB-α的抗体购自美国马萨诸塞州丹弗斯的Cell Signaling Technology公司；IBA-1抗体购自中国武汉的Servicebio公司。3.2 动物与处理：实验用小鼠为6–8周龄、平均体重20±2克的C57BL/6J雄性小鼠，来自陆军医科大学实验动物中心。所有实验操作均获得陆军医科大学动物福利与伦理委员会的批准（编号AMUWEC20230307）。小鼠在标准条件（22–24°C，40–70%湿度）下适应一周后，被随机分为四组：对照组、T-2毒素组、白藜芦醇组以及T-2毒素+白藜芦醇组，每组6只。参照先前的研究，T-2毒素和白藜芦醇粉末均溶解在二甲基亚砜中用于给药[12]、[43]，所有处理均通过腹腔注射的方式实施，对照组则仅注射二甲基亚砜。根据之前的研究，T-2毒素的剂量为4mg/kg，该剂量可诱导小胶质细胞活化及神经行为缺陷，但不致导致小鼠死亡[20]；白藜芦醇的剂量为100mg/kg，该剂量可在我们之前的小鼠研究中抑制促炎性小胶质细胞活化[24]。在T-2毒素+白藜芦醇组中，小鼠首先接受一次白藜芦醇腹腔注射，24小时后再接受一次T-2毒素腹腔注射。行为测试结束后，用0.3%的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，随后采集脑组织样本。3.3 莫里斯水迷宫试验：该试验用于检测小鼠的空间学习与记忆能力。试验装置为一个圆形水池，分为四个相等的象限，其中一个指定象限中藏有一个平台。在四天的训练阶段，小鼠每天进行四次训练，每次训练间隔15–20分钟。每次试验时，将小鼠从不同的起始位置轻轻放入水中，给予60秒时间让其找到隐藏的平台；若小鼠在规定时间内未能找到平台，则由实验人员轻轻引导其找到平台，并让其在平台上停留10秒。第五天进行无平台的探查试验，每只小鼠可自由游泳60秒，相关数据会被记录下来。3.4 开放场试验：该试验用于进一步评估小鼠的运动活力和探索行为。试验装置为一个方形场地，将小鼠置于场地中央，让其自由探索5分钟。每次试验之间用75%的乙醇清洁试验装置。3.5 免疫荧光染色：脑组织先在4%的多聚甲醛中固定，然后在30%的蔗糖中低温保存，之后嵌入OCT中用于冷冻切片。切片先用0.3%的Triton X-100处理以使其通透，再用3%的牛血清白蛋白封闭，最后在4°C下与一级抗体（IBA-1为小鼠单克隆抗体，BTG2为兔多克隆抗体）共同孵育过夜。孵育完成后，加入Alexa Fluor 488和Cy3标记的二级抗体，再用DAPI对细胞核进行复染。图像采用共聚焦激光扫描显微镜拍摄，所有组的曝光参数保持一致。3.6 细胞培养与处理：BV-2小胶质细胞购自中国科学院细胞库（中国上海），在含5%二氧化碳、温度为37°C的DMEM培养基中培养，该培养基添加了10%的胎牛血清（中国杭州的Every Green公司提供）以及1%的青霉素/链霉素（中国北京的Biosharp公司提供）。处于对数生长期的BV-2细胞以5×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中。细胞贴壁后，根据实验设计施加不同处理。根据初步研究，T-2毒素的最终浓度为5ng/mL[20]；在T-2毒素+白藜芦醇组中，细胞在接触T-2毒素之前先暴露于白藜芦醇中2小时。处理后6小时和12小时分别提取细胞中的RNA和蛋白质，用于后续分析。3.7 细胞转染：采用GenePharma公司（中国上海）的GP-transfect-Mate转染试剂盒，通过siRNA在BV-2小胶质细胞中实现BTG2的敲低。按照制造商提供的方案完成转染后，将细胞继续培养。4–6小时后，更换新鲜的完全培养基。转染后24–72小时检测mRNA水平，48–96小时分析蛋白质表达情况。siRNA序列详见表S2。3.8 细胞存活率分析：采用MTT法检测细胞存活率。将BV-2细胞接种到96孔板中，每孔1.5×104个细胞。细胞贴壁后，将其暴露于不同浓度的白藜芦醇中24小时。处理完成后，加入5mg/mL的MTT溶液（中国上海的贝泰姆公司提供），在37°C下继续孵育4小时。随后用二甲基亚砜溶解甲酚蓝结晶，于490nm波长处测定吸光度值。3.9 定量实时PCR检测：通过qRT-PCR分析目标基因的mRNA表达水平。从BV-2细胞和小鼠脑组织中提取总RNA，所用提取试剂盒来自美国威斯康星州麦迪逊的Promega公司。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒从提取的RNA中合成cDNA，之后采用SYBR Green体系进行PCR扩增，通过2–ΔΔCt方法计算相对基因表达量。表1列出了本研究中使用的所有引物序列。表1 本研究中所用的引物序列名称 序列（5′-3′）BTG2：FCGC ACT GAC CGA TCA TTA CAA ABT BG2：RGAT GCG GTA GGA CAC TTC GTGA GAPDH：FAGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GAPDH：RTGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA IL-1β：FCGC AGC AGC ACA TCA ACA AGA GC IL-1β：RTGT CCT CAT CCT GGA AGG TCC ACG IL-6：FCCA GAG ATA CAA AGA AAT GAT GG IL-6：RACT CCA GAA GAC CAG AGG AA AT NF-α：FATG GCC TCC CTC TCA TCA GTT NF-α：RTTT GCT ACG ACG TGG GCT ACC OX-2：FGAA ATA TCA GGT CAT TGG TGG AGCOX-2：RGTT TGG AAT AGT TGC TCA TCA CTLR4：FATC CCT GCA TAG AGG TGT GAAT LR4：RCCA GAG AAA CTT CCT GGG GAA A3.10 西部印迹试验：使用Beyotime公司（中国上海）的RIPA裂解缓冲液制备细胞裂解液，通过Thermo公司（美国）的BCA试剂测定蛋白质浓度。将30μg的蛋白质样品经10%的SDS-PAGE分离后，转移至Millipore公司（美国马萨诸塞州比勒里卡）生产的PVDF膜上。膜在5%脱脂牛奶中封闭1小时后，分别与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后再与相应的HRP标记的二级抗体在室温下孵育1小时。信号通过ECL显色底物显现，最后使用ImageJ软件进行定量分析。3.11 RNA测序：按照2.7节所述，用NC siRNA或BTG2特异性siRNA对BV-2细胞进行转染。48小时后，用TaKaRa公司的TRIzol试剂提取总RNA，然后将样本送至中国武汉的Metware Biotechnology Co., Ltd.公司，进行RNA质量检测、文库构建，最后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。每组包含5个生物学重复样本。将干净的读取序列用HISAT2工具与小鼠参考基因组GRCm39比对，再利用featureCounts工具计算基因表达水平。通过DESeq2软件进行NC组与siBTG2组之间的差异表达分析，筛选标准为|log2FC|≥1且P<0.05。功能富集分析则采用clusterProfiler工具完成。3.12 统计分析：所有定量数据均以均值±标准误的形式呈现。4. 结果
4.1 Res可修复T-2毒素诱导的小鼠神经行为缺陷
为评估T-2毒素引起的神经行为缺陷以及Res的潜在治疗作用，研究人员建立了小鼠模型，并让其完成莫里斯水迷宫测试和开放场地测试。在莫里斯水迷宫实验中，T-2毒素暴露显著影响了空间学习能力，表现为导航阶段的游泳路径紊乱，且第4天的逃脱潜伏期明显延长；而预先给予Res处理可显著改善这些学习缺陷（图S1A、B）。在第5天的空间探查试验中，T-2毒素组表现出典型的搜索模式异常（图S1C），同时平台穿越次数减少（图S1D），在目标象限停留的时间也较短（图S1E）。Res的处理有效逆转了这些认知功能损害（图S1D、E）。

在开放场地测试中，T-2毒素暴露导致小鼠活动量减少，表现为总移动距离缩短（图1B），探索意愿下降，进入中心区域次数减少且停留时间缩短（图1C、D）。典型的运动轨迹见图1A。值得注意的是，预先给予Res处理可有效抵消这些行为异常，恢复小鼠的整体运动能力和探索行为（图1B–D）。

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图1. Res可改善T-2毒素诱导的小鼠神经行为缺陷。(A) 开放场地测试中的典型运动轨迹。(B) 总移动距离。(C) 进入中心区域的次数。(D) 在中心区域停留的时间。** P＜0.01，与对照组相比；# P＜0.05，## P＜0.01，与T-2毒素组相比。

4.2 Res可减轻T-2毒素在体内诱导的BTG2表达及神经炎症
为探究T-2毒素是否会在体内引发小胶质细胞活化并改变BTG2的表达，研究人员进行了免疫荧光分析。结果显示，T-2毒素暴露会显著提高海马区BTG2的荧光强度（图2A、B）。与此同时，T-2毒素处理还会引起明显的小胶质细胞活化，表现为海马区小胶质细胞标记物IBA-1的荧光强度显著升高（图2A、C）。预先给予Res处理可有效逆转这些变化，显著降低T-2毒素诱导的BTG2和IBA-1荧光强度的上升。大脑皮层中也观察到了类似的趋势（图S2A–C）。

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图2. Res可抑制T-2毒素在海马区诱导的BTG2表达上调及小胶质细胞活化。(A) 海马区BTG2（绿色）和IBA-1（红色）的典型免疫荧光图像。(B–C) 海马区BTG2和IBA-1荧光强度的定量分析。比例尺：50μm。** P＜0.01，*** P＜0.001，与对照组相比；# P＜0.05，## P＜0.01，与T-2毒素组相比。

进一步通过qRT-PCR和西方印迹技术分析了BTG2及神经炎症介质在体内的表达水平。研究结果表明，T-2毒素暴露会显著提高海马区及大脑皮层中BTG2的mRNA水平（图3A、图S3A），这一现象也得到了蛋白质表达升高的证实（图3B、C，图S3B、C）。同时，T-2毒素还会在海马区及大脑皮层引发显著的神经炎症反应，表现为多种促炎介质的mRNA表达显著增加，包括COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α（图3D–G，图S3D–G）。预先给予Res处理可有效抵消这些变化，显著逆转T-2毒素诱导的BTG2及上述促炎细胞因子的升高。总体而言，这些数据表明Res的抗神经毒性作用与它对BTG2过度表达及小胶质细胞活化的抑制密切相关。

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图3. Res可改善T-2毒素在海马区诱导的BTG2表达上调及神经炎症。(A) 通过qRT-PCR测定的海马区BTG2的mRNA表达水平。(B–C) 通过西方印迹技术分析的海马区BTG2的蛋白质表达水平。(D–G) 通过qRT-PCR测定的海马区促炎介质的mRNA表达水平：(D) COX-2，(E) IL-1β，(F) IL-6，(G) TNF-α。** P＜0.01，*** P＜0.001，与对照组相比；# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001，与T-2毒素组相比。

4.3 Res可抑制T-2毒素在体内诱导的TLR4/MyD88/NF-κB通路活化
为揭示Res缓解神经炎症的潜在信号机制，研究人员检测了大脑皮层中TLR4/MyD88/NF-κB通路的活性。西方印迹分析显示，T-2毒素暴露会显著提高TLR4及其适配蛋白MyD88的蛋白质表达水平（图S3H–J）。此外，T-2毒素处理还会显著促进NF-κB p65和IκB-α的磷酸化（图S3K–M），表明NF-κB信号通路已被激活。重要的是，预先给予Res处理可显著逆转这些变化。T-2+Res组的TLR4、MyD88蛋白质水平，以及p-p65/p65和p-IκB-α/IκB-α的比例，均显著低于单独使用T-2毒素的组别（图S3H–M）。

4.4 Res可在体外抑制T-2毒素诱导的BTG2表达上调、神经炎症及TLR4/MyD88/NF-κB通路活化
为在体外验证Res的抗神经毒性机制，研究人员使用了BV-2小胶质细胞。MTT试验显示，当Res浓度达到100μM时，细胞存活率显著下降，因此后续机制研究选择50μM作为工作浓度（图4A）。T-2毒素暴露会显著增加BTG2的mRNA和蛋白质含量（图4B–D），并引发强烈的促炎反应，使COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平升高（图4E–H）。此外，T-2毒素还会提高TLR4和MyD88的蛋白质水平，并增强p65和IκB-α的磷酸化程度（图4I–N）。Res处理可有效逆转这些变化。与T-2毒素组相比，T-2+Res组的BTG2、炎症细胞因子以及TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白质的水平均显著降低。这些结果表明，T-2毒素会在BV-2细胞中诱导BTG2表达上调、神经炎症及TLR4/MyD88/NF-κB通路活化，而Res可有效逆转这些效应。

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图4. Res可抑制T-2毒素在BV-2小胶质细胞中诱导的BTG2表达上调、炎症反应及TLR4/MyD88/NF-κB通路活化。(A) 通过MTT试验测定的细胞存活率。(B) 通过qRT-PCR测定的BTG2的mRNA表达水平。(C–D) 通过西方印迹技术分析的BTG2蛋白质表达水平。(E–H) 通过qRT-PCR测定的炎症因子mRNA表达水平：(E) COX-2，(F) IL-1β，(G) IL-6，(H) TNF-α。(I–N) TLR4/MyD88/NF-κB通路的西方印迹分析结果。** P＜0.01，*** P＜0.001，与对照组相比；# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001，与T-2毒素组相比。

4.5 BTG2是通过TLR4/MyD88/NF-κB通路在T-2毒素诱导的神经炎症中起关键调节作用
为探究BTG2在T-2毒素介导的神经炎症中的作用，研究人员在BV-2细胞中通过siRNA技术抑制了BTG2的表达。siRNA介导的基因沉默在转录和翻译层面均有效降低了BTG2的表达水平（图S4A–C）。这一抑制作用显著减少了T-2毒素引发的炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的生成（图5A–C），同时也降低了TLR4的mRNA表达水平（图5D）。此外，BTG2基因沉默还抑制了T-2毒素诱导的TLR4、MyD88的蛋白质表达，以及p65和IκB-α的磷酸化程度（图5E–J）。这些结果表明，BTG2通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号轴，在响应T-2毒素时发挥调控小胶质细胞炎症活化的作用。

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图5. 抑制BTG2可减轻T-2毒素在BV-2小胶质细胞中诱导的炎症反应及TLR4/MyD88/NF-κB通路活化。(A–C) 通过qRT-PCR测定的各炎症因子的mRNA表达水平：(A) IL-1β，(B) IL-6，(C) TNF-α。(D) 通过qRT-PCR测定的TLR4的mRNA表达水平。(E–J) TLR4/MyD88/NF-κB通路的西方印迹分析结果。** P＜0.01，*** P＜0.001，与对照组相比；# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001，与T-2毒素组相比。

4.6 RNA测序从整体上证实了BTG2在TLR4/MyD88/NF-κB信号轴中的调节作用
为全面验证BTG2在小胶质细胞炎症及TLR4/MyD88/NF-κB通路中的调节作用，研究人员在siRNA抑制BTG2表达后的BV-2细胞进行了RNA测序。主成分分析显示，NC组与siBTG2组之间存在明显的分群差异，表明BTG2被抑制后会导致显著的转录组变化（图S5A）。共鉴定出133个差异表达基因，其中57个基因表达上调，76个基因表达下调（图S5B）。基因本体论分析显示，这些差异基因大多与炎症反应及免疫调节相关的生物过程有关（图S5C）。KEGG通路分析进一步证实，这些基因主要富集在NF-κB通路及Toll样受体通路中（图S5D）。Reactome分析则明确指出，“TLR4信号级联”是受BTG2基因沉默显著影响的通路之一（图S5E）。总体而言，这些高通量数据为BTG2在BV-2小胶质细胞中作为TLR4/MyD88/NF-κB信号轴的核心上游调节因子提供了有力的证据。

5. 讨论
T-2毒素的神经毒性对动物和人类健康构成严重威胁，但其在中枢神经系统引发促炎性病理变化的精确分子机制至今尚未完全明了。本研究表明，T-2毒素通过上调BTG2来诱发神经行为缺陷和神经炎症，进而激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。此外，研究还发现Res可通过抑制该信号通路发挥神经保护作用，其具体机制可能与BTG2存在相互作用，这一细节有待后续研究进一步阐明。据我们所知，这是首项阐明BTG2在TLR4通路中调节作用的研究，同时也确定了BTG2是Res缓解T-2毒素诱导的小胶质细胞活化作用的关键分子靶点。

已知T-2毒素能够穿过血脑屏障并在大脑中积累，从而导致多种神经系统症状。这些研究结果与先前关于T-2毒素可引发认知功能障碍的研究结论一致[14]。我们的行为学实验表明，T-2毒素会严重损害小鼠在莫里斯水迷宫中的空间学习和记忆能力，同时在开放场地测试中也会降低其探索欲望和运动能力。我们之前的研究也得到了类似的结果，进一步证明了T-2毒素的强神经毒性[19]、[31]。在细胞实验中，T-2毒素可直接引发神经炎症，上调NF-κB的表达，并促进IL-6、TNF-α和IL-8等促炎细胞因子的分泌[27]。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，是应对神经毒性损伤的主要细胞类型[36]。根据其活化状态的不同，小胶质细胞可在神经系统中发挥多种功能：它们既能发挥神经保护和修复作用，也可能转向促炎表型，进而对中枢神经系统造成损害[29]。我们的研究结果证实，T-2毒素会引发强烈的炎症级联反应，表现为小胶质细胞活化以及促炎因子的过度分泌。这一结果与现有文献中关于不受控制的神经炎症可能是霉菌毒素诱发神经元损伤和认知功能下降的驱动因素的观点相吻合[21]。

本研究的一个关键发现是，BTG2在T-2毒素诱导的炎症级联反应中起着核心的上游调节作用。虽然BTG2传统上被认为具有调控细胞周期停滞和抑制肿瘤的作用[35]，但其在神经炎症中的作用尚不明确。我们之前的研究已发现BTG2可能参与T-2毒素诱导的小胶质细胞促炎活化过程[20]。在此基础上，本研究进一步证实，T-2毒素暴露后，BTG2与TLR4/MyD88/NF-κB通路相关成分会同步上调。通过在BV-2细胞中利用siRNA抑制BTG2的表达，进一步证实了BTG2在这一过程中的功能性必要性。抑制BTG2不仅能够减少促炎因子的产生，还能显著抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的活性。这表明BTG2并非仅仅对压力作出反应，而是主动参与推动TLR4通路的活化。

TLR4/MyD88/NF-κB通路是启动炎症反应的经典信号通路。一旦被激活，TLR4会招募MyD88，促使IκB-α磷酸化，进而释放NF-κB，使其转移至细胞核并启动细胞因子的转录[26]。我们的研究结果表明，T-2毒素会在神经组织和小胶质细胞中激活这一通路，最终导致神经毒性效应。Wei等人也证实，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化会在体内和体外引发小胶质细胞活化，进而导致神经炎症和认知功能受损[40]。值得注意的是，本研究首次发现BTG2基因沉默可显著抑制TLR4的表达，这说明BTG2可能通过调控TLR4的稳定性或转录水平，或作为辅助因子促进依赖MyD88的信号复合体形成，从而调节TLR4信号通路。转录组数据进一步证实了BTG2在TLR4信号通路中的调节作用，同时表明BTG2可能还负责协调小胶质细胞的免疫反应网络，从而整体逆转T-2毒素诱导的促炎表型。

已有研究表明，Res可通过调控不同病理环境下的小胶质细胞活化来发挥神经保护作用，例如在术后认知功能障碍中[23]。同样，它在脑瘫大鼠模型中能够减轻海马区小胶质细胞的活化，并保护记忆功能[2]。与这些研究结果一致，我们的研究表明，预处理Res可显著改善T-2毒素引起的行为缺陷，并抑制小胶质细胞的活化，从而凸显了其在预防霉菌毒素引起的中枢神经系统损伤方面的神经保护作用。此外，这一结果也与先前的研究相符，即Res在脑缺血和阿尔茨海默病等神经炎症模型中能够抑制TLR4信号通路[3]、[18]。我们的研究显示，预处理Res可降低BTG2的表达，并阻断TLR4/MyD88/NF-κB通路。结合这些观察结果以及我们的siRNA干扰实验，可以推断Res的神经保护作用主要是通过靶向调控BTG2来实现的。通过抑制BTG2的过度表达，Res有效地从源头限制了TLR4信号通路的激活，进而减轻了T-2毒素引起的神经炎症损伤。

6. 结论
本研究表明，T-2毒素通过上调BTG2来引发神经炎症和认知功能障碍，而BTG2又会激活TLR4/MyD88/NF-κB通路。此外，Res通过靶向这一新的BTG2/TLR4通路发挥神经保护作用。这些发现不仅深化了人们对T-2毒素分子毒理学的认识，还将BTG2视为潜在的治疗靶点，同时将Res视为预防霉菌毒素引起神经系统疾病的有望候选物质。

CRediT作者贡献说明
徐武伟：撰写——初稿、可视化、方法学、正式分析、数据整理。徐燕欣：可视化、研究、数据整理。姚春燕：方法学、资金获取、数据整理。傅仙梅：可视化、数据整理。刘晓玲：资源提供、正式分析。范金平：验证、资源提供。王克学：方法学、数据整理。周玉萌：概念设计。李月飞：概念设计。胡婷：资源提供。赛燕：监督、资源提供、项目管理。罗鹏：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。蔡同健：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念设计。

徐武伟|徐燕欣|姚春燕|傅仙梅|刘晓玲|范金平|王克学|周玉萌|李月飞|胡婷|赛燕|罗鹏|蔡同健