有条件删除Bmal1会轻微改变脊髓挫伤后的急性病理变化，但不影响功能恢复

《Neuroscience Letters》：Conditional deletion of Bmal1 modestly alters acute pathology without affecting functional recovery after contusive spinal cord injury

　　摘要：研究表明，对小鼠进行T9水平的中度挫伤性脊髓损伤后，若在生殖系中删除核心昼夜节律转录因子Bmal1，可减少血脑屏障的破坏及组织损失。因此，本研究采用相同模型检测了条件性Bmal1缺失的效应。携带广泛表达的Cag-CreERT2重组酶转基因的Bmal1loxp/loxp年轻成年小鼠在经他莫昔芬处理后，其大脑或脊髓中的Bmal1表达显著降低。与此相应的，BMAL1的典型靶基因Nr1d1和Dbp也出现下调。然而，在脊髓损伤后3天，仅有少数组织损伤标志物出现轻度下降，且运动功能恢复及白质保护效果均未得到改善。在内皮细胞特异性的Bmal1-/-小鼠（Cdh5-Cre:Bmal1loxp/loxp）中也观察到了类似的脊髓损伤表型，部分急性损伤标志物有所减弱，但功能恢复及长期组织保护方面并无显著影响。这些数据表明，Bmal1的生殖系缺失可通过发育过程中产生的、涉及非内皮细胞的基因表达补偿机制来保护脊髓免受损伤，因此BMAL1不太可能直接参与脊髓损伤后引发的继发性损伤过程。

引言：脊髓损伤会引发继发性损伤反应，进而加剧组织损失并导致功能衰退[1]、[2]。挫伤性脊髓损伤后，出血及血脑屏障的破坏会引发细胞毒性神经炎症和氧化应激，从而导致脊髓损伤范围扩大，形成纤维化疤痕和/或囊性空腔，阻碍神经修复[3]。尽管目前尚无临床有效的神经保护疗法，但人们非常希望找到继发性损伤反应的介导因子作为潜在的治疗靶点。脑和肌肉中的ARNT样1蛋白（BMAL1）是一种碱性螺旋-环-螺旋结构转录因子，它与CLOCK或NPAS2等蛋白共同调控基因表达的昼夜节律[4]、[5]、[6]。BMAL1调控的基因包括昼夜节律时钟的核心组分以及众多组织特异性基因[7]、[8]。这些基因的节律性表达有助于调节新陈代谢、免疫/炎症反应及抗氧化防御等生理功能[6]、[9]、[10]。BMAL1是时钟通路输出中唯一不可替代的成分，其在小鼠中的生殖系缺失会打破机体稳态，导致加速衰老[11]、止血功能紊乱[12]、[13]、血管功能异常[14]、动脉粥样硬化加重[15]以及大脑抗氧化能力下降[16]。在特定细胞类型中删除Bmal1也会引发病理表型，如内皮细胞特异性敲除小鼠会出现血栓形成增加、血管功能障碍、血管新生受阻以及血脑屏障完整性改变[12]、[17]、[18]、[19]。这些发现凸显了内皮细胞昼夜节律在维持血管稳态，尤其是止血功能和屏障功能方面的重要作用。出乎意料的是，T9水平发生中度挫伤性脊髓损伤后，Bmal1-/-小鼠的运动功能恢复及白质保护效果反而更好[20]。这一现象出现之前，其血脑屏障已得到显著保护，出血量减少，神经炎症也有所减轻。这些发现提示，除了承担正常的昼夜节律调控功能外，BMAL1还可能参与脊髓损伤后的继发性损伤过程。鉴于内皮细胞在调控止血功能及血脑屏障完整性中的作用，这些细胞中BMAL1的功能障碍可能对脊髓损伤的发病机制有重要影响。不过，BMAL1在发育过程中会在多种细胞类型中广泛表达，且其表达大多并非具有节律性，这表明它还具有其他功能[21]。值得注意的是，尽管昼夜节律会被同样程度地打破，但生殖系缺失与可诱导的成年期缺失所产生的表型却可能存在差异[15]。例如，在动脉粥样硬化模型中，两种缺失方式对血管损伤的影响截然相反，这很可能与生殖系缺失带来的发育适应性变化有关[15]。与之相符的是，已有研究将罕见的BMAL1错义突变与人类神经发育综合征联系起来[22]。因此，Bmal1-/-小鼠脊髓损伤后果的改善，可能是由于BMAL1参与了继发性损伤过程或发育过程。为区分这两种可能性，本研究探讨了在成年小鼠的所有细胞或仅在内皮细胞中条件性删除Bmal1，是否能够重现生殖系Bmal1-/-小鼠的脊髓损伤表型。

结果：全细胞型成年期删除Bmal1的效应。为诱导Bmal1缺失，最初采用了如前文所述的方法[23]，即每天注射9次他莫昔芬（1毫克，腹腔注射）。该方案使大脑皮层中的Bmal1 mRNA表达降低了57%，受伤脊髓中的BMAL1蛋白水平下降了70%，说明iBmal1-/-小鼠的重组效率仅为中等水平（见补充图S1）。因此，研究人员改用了另一种高剂量诱导方案——该方案此前已被成功用于生成iBmal1-/-小鼠[15]，具体为每隔一天口服3次、每次5毫克的他莫昔芬（详见材料与方法部分）。在他莫昔芬处理完成三周后，高剂量方案的重组效率明显高于低剂量方案：低剂量方案处理后大脑皮层中的Bmal1 mRNA表达仅为野生型水平的42.2±21.0%，而高剂量方案处理后则降至12.8±4.5%（p<0.05，U检验，见补充图S1）。在未受伤的iBmal1-/-小鼠中，脊髓中的Bmal1 mRNA表达降至野生型水平的21.8±2.5%，说明脊髓中的重组效率略低于大脑皮层（p<0.05，U检验，见图1A）。重要的是，脊髓中Bmal1表达的下降伴随着BMAL1的典型靶基因Nr1d1和Dbp的表达相应降低，进一步证实了BMAL1的转录活性下降（见图1A）。下载：下载高分辨率图像（273KB）；下载：下载全尺寸图像。图1：iBmal1-/-小鼠脊髓中Bmal1 mRNA的表达下降情况。对完整胸段脊髓（A）或损伤中心区域在损伤后3天的mRNA表达进行了qPCR分析（T9水平施加50 kdyn的冲击力造成损伤，B）。A项显示，Bmal1及其靶基因（Nr1d1和Dbp）的表达下降，证明在完整脊髓中已实现有效敲除。B项显示，脊髓损伤后，Bmal1和Nr1d1的表达仍较低，而昼夜节律通路的另外三种转录本则表达上升。数据为平均值±标准差；**p<0.01，*p<0.05；ns表示p>0.05，U检验。另一项使用高剂量诱导方案的研究也显示，损伤后3天，挫伤脊髓中的Bmal1和Nr1d1表达依然处于下降状态（见图1B）。不过Dbp的表达未受影响，这可能是因为它在神经元中表达较多，而脊髓损伤后会丢失这些神经元（参考Allen脑图谱）。实际上，野生型小鼠在脊髓损伤后会立即出现Dbp表达的急剧下降[20]。此外，还有几种其他由BMAL1调控的转录本（Cry1、Per2和Npas2）表达上升，分别为野生型的1.9倍、2.6倍和5.2倍（见图1B），表明昼夜节律时钟通路存在失调。不过，针对脊髓损伤病理特征的mRNA标记物分析显示，iBmal1-/-小鼠的异常表现较为有限。这些异常包括反应性星形胶质细胞标记物Gfap的表达升高（+47%），以及与纤维化相关（Fn1，下降42%）、血脑屏障破坏相关（Thbd和Timp1，分别下降55%和38%）、整体应激反应相关（Tnfrsf10b、Calr和Manf，分别下降52%、26%和23%）和细胞增殖相关（Cdk1，下降53%）的标记物表达下降（见图2A–E）。相比之下，少突胶质细胞和神经元相关的标记物表达并未发生变化，说明脊髓损伤后这些细胞类型的急性丢失并未受到影响（见图2A）。如此有限的异常表现与通过BMS测试或水平梯子测试评估的运动功能恢复情况一致，这些测试用于评价包括感觉-运动协调能力在内的精细运动技能，结果显示运动功能未受影响（见图2F–G）。此外，在损伤后42天时，iBmal1-/-小鼠与野生型小鼠的白质保护程度相似（见图2H）。同样，在42天时，两种小鼠的白质保护情况也无差异（见图2H）。由此可见，成年期全细胞型删除Bmal1并不能重现生殖系Bmal1-/-小鼠所表现的急性病理损伤显著减轻及功能恢复更好的现象。下载：下载高分辨率图像（824KB）；下载：下载全尺寸图像。图2：iBmal1-/-小鼠的脊髓损伤表型。A–E项为损伤后3天对损伤中心区域主要脊髓细胞类型、神经炎症、血脑屏障破坏、整体应激反应及细胞增殖相关mRNA标记物的qPCR分析结果。可见，这些指标的异常均较为有限。F–G项显示，脊髓损伤后的功能恢复未受影响。无论是BMS评分还是其子评分，都未显示出iBmal1-/-小鼠与野生型小鼠在下肢功能方面存在显著差异（F项）。水平梯子测试的结果也显示，两种小鼠的精细运动技能受损程度相似（G项）。对于基因型或基因型与恢复时间之间的交互作用进行的双因素RM-ANOVA主效应分析显示，p值均大于0.05（详细结果见补充表S2）。H项显示，损伤后42天时，iBmal1-/-小鼠与野生型小鼠在损伤中心的白质保护程度相似。图中展示了花青素髓鞘染色の代表性图像，图表显示了相对白质保护程度（%EC+，即髓鞘化的白质面积占比）。数据为平均值±标准差；*p<0.05；ns表示p>0.05，U检验。内皮细胞特异性删除Bmal1的效应。通过将Bmal1lox/lox小鼠与恒定表达内皮Cre序列的Cdh5-cre品系进行杂交，培育出了内皮细胞特异性的Bmal1敲除小鼠（EC-Bmal1-/-）[24]。后者能在胚胎第14.5天时在95%以上的内皮细胞中引发loxp介导的重组，而在成年后的血管组织中，包括大脑内的血管，也能几乎完全实现重组[24]、[25]。在损伤后3天时，EC-Bmal1-/-小鼠的损伤中心区域的细胞类型相关mRNA及炎症相关mRNA均无显著变化（见图3A及补充图S1）。虽然所有与血脑屏障破坏相关的标记物都呈现下降趋势，但只有Selp和Tubb6的表达出现了显著降低（见图3B）。这些基因的昼夜节律性表达特征[20]、[26]、[27]，以及已有研究报道的Bmal1删除后Tubb6表达下降的现象[28]，都为BMAL1对这些基因的调控作用提供了支持。仅有1个与整体应激反应相关的标记物（Manf，为野生型的0.71倍）表达下降，而细胞增殖相关的标记物表达则未发生变化（见补充图S1）。与这些有限的分子学变化相对应，EC-Bmal1-/-小鼠与野生型同窝小鼠在下肢功能恢复（BMS评分）、精细运动技能（水平梯子测试）以及损伤后42天的亚慢性白质保护程度方面均无显著差异（见图3C–F）。下载：下载高分辨率图像（628KB）；下载：下载全尺寸图像。图3：EC-Bmal1-/-小鼠的脊髓损伤表型。A–B项为损伤后3天对损伤中心区域主要脊髓细胞类型、血脑屏障破坏相关标记物mRNA的qPCR分析结果。虽然所有与血脑屏障破坏相关的标记物都呈现下降趋势，但仅有两个标记物的表达出现显著降低（见B项）。神经炎症、整体应激反应及细胞增殖相关的标记物表达均无显著变化，仅有整体应激反应相关的Manf标记物表达下降（见补充图S1）。C–D项显示，脊髓损伤后的功能恢复未受影响。无论是BMS评分还是其子评分，都未显示出EC-Bmal1-/-小鼠与野生型小鼠在下肢功能方面存在显著差异（见C项）。水平梯子测试的结果也显示，两种小鼠的精细运动技能受损程度相似（见D项）。对于基因型或基因型与恢复时间之间的交互作用进行的双因素RM-ANOVA主效应分析显示，p值均大于0.05（详细结果见补充表S2）。E–F项显示，损伤后42天时，EC-Bmal1-/-小鼠与野生型小鼠在损伤中心的白质保护程度相似。E项展示了花青素髓鞘染色的代表性图像。F项给出了相对白质保护程度的量化数值（即髓鞘化白质面积占比）。数据为平均值±标准差；*p<0.05；ns表示p>0.05，U检验。

讨论：本研究结果表明，成年期全细胞型删除Bmal1无法重现生殖系删除Bmal1在功能恢复及脊髓损伤后病理表现方面的有益效果。因此，BMAL1不太可能直接参与脊髓损伤后引发的继发性损伤过程。相反，Bmal1-/-小鼠所表现出的更好恢复效果，很可能是由发育过程中形成的间接机制所导致的。由于EC-Bmal1-/-小鼠的脊髓损伤表型也没有明显变化，这说明在胚胎发育阶段特异性丢失Bmal1并不足以激活这些保护性机制。另一种可能性是，脊髓损伤的发病机制可能与iBmal1-/-小鼠体内残留的20%的Bmal1有关。即便如此，BMAL1也不太可能成为神经保护疗法的理想靶点，因为要实现完全抑制Bmal1的功能，很可能会影响这类疗法的药理效果或临床应用可行性。在多个系统中，已经有多种研究报道了恒定型（胚胎期）与成年期Bmal1删除所产生的不同表型，比如动脉粥样硬化的程度不同、脱毛与毛发生长加速的情况相反，以及持续低血压与正常血压的表现差异[15]、[29]。在某些情况下，胚胎期删除会导致更严重的表型，比如骨骼异常[29]；不过在多巴胺能神经元退行性疾病中，情况则相反，成年期删除才会产生更明显的症状[30]、[31]。从机制上来看，生殖系删除或早期发育阶段的删除更有可能引发更强的代偿性适应。正如Bmal1-/-小鼠与iBmal1-/-小鼠相比，其神经元退行性病变的表型相对较轻所示，这类代偿性适应或许能够减轻病理损伤的严重程度[30]、[31]。通过类比，Bmal1-/-小鼠相较于iBmal1-/-小鼠表现出更好的脊髓损伤预后，这可能源于一些补偿机制，这些机制能够提升组织对机械性损伤的抵御能力，或是减弱继发性损伤反应的破坏性效应。有趣的是，Bmal1-/-小鼠会出现全身性的内分泌改变，而这种改变在仅针对特定组织的基因敲除中并未出现[32]。尽管胰岛素分泌减少，但瘦素水平升高被认为有助于改善葡萄糖耐受性[32]；而雌二醇水平上升以及性激素信号传导向雌性特征倾斜，则被认为有助于预防饮食诱发的肝脂肪变性和局灶性皮质缺血[32][33]。瘦素和雌二醇都具有神经保护作用，能够改善挤压性脊髓损伤的预后[34][35]。因此，Bmal1-/-小鼠体内这两种激素水平的升高，可能有助于减少组织损伤并促进功能恢复。一个重要的问题是：究竟是哪些基因的调控发生改变，从而导致了Bmal1-/-小鼠的脊髓损伤表型？我们之前对挤压伤后脊髓组织（受伤3天时）进行的RNA测序分析发现，Igfbpl1是Bmal1-/-小鼠中上调最显著的基因之一[20]。IGFBPL1属于IGFBP7家族，可作为IGFR信号的增强因子，它能促进轴突的生长与再生[36]，增强突触连接[37]，抑制小胶质细胞的炎症反应[38]，并减少巨噬细胞中的脂质积累[39]。这些生物学功能与Bmal1-/-小鼠中观察到的更好脊髓损伤预后及更低的神经炎症程度相一致[20]。qPCR分析也证实，Bmal1-/-小鼠挤压伤后的脊髓中Igfbpl1表达显著升高（为正常对照组的68.7倍），在完整脊髓中也存在类似的趋势（见补充图S2）。虽然iBmal1-/-小鼠中Igfbpl1也有上调，但其上调幅度要低得多（仅为正常对照组的5.9倍），这一结果进一步支持了该基因作为保护性表型介导因子的可能性（见补充图S2）。那么，种系中Bmal1的缺失为何会引发持久的基因表达变化呢？一种可能性是BMAL1直接调控染色质结构，从而造成持久的表观遗传抑制。因此，当BMAL1缺失后，这类基因就可能被上调。事实上，已有研究显示Igfbpl1在胎儿发育期间表达水平很高，出生后会迅速下降[36]。在胚胎早期——即生物钟节律尚未形成之前——BMAL1会与TRIM28相互作用，以沉默转座子并调控与细胞分化相关的基因[40]。此外，BMAL1还可能通过影响表观遗传状态的代谢途径，间接调控基因表达[41]。这类机制或许能形成持续的转录程序，进而影响成年个体对损伤的反应。要确定哪些具体基因导致了Bmal1-/-小鼠脊髓损伤预后的改善，还需要进一步的研究。血管损伤——包括出血、微血管灌注不足以及血脑屏障功能受损——是脊髓损伤病理过程中的重要因素[1][2][42]。血脑屏障完整性的下降部分是由于损伤引发的血管新生现象，其表现为损伤核心区域出现内皮细胞增殖以及功能异常的微血管形成[43][44][45]。在Bmal1-/-小鼠中，脊髓损伤伴随的出血量减少、血脑屏障完整性提高，以及细胞增殖降低[20]。尽管特异性针对内皮细胞的Bmal1缺失会促进血栓形成并抑制血管新生[12][18]，但在本研究中并未显著影响脊髓损伤的预后。不过，仍有几项与内皮细胞相关的血脑屏障功能破坏标志物呈现出持续下降的趋势（见图3）。即便血管完整性与功能的改善是种系Bmal1缺失对脊髓损伤产生有益作用的的重要原因，但非内皮细胞中Bmal1的缺失可能也对这种改善起着关键作用。例如，Bmal1-/-小鼠体内升高的循环瘦素和雌二醇水平，虽然主要来自非血管组织，但仍可能对中枢神经系统的血管起到保护作用[32][33][46][47][48]。当前实验设计存在一些局限性，值得注意。最突出的是，可诱导的基因敲除方式会导致残留的Bmal1表达（约为正常对照组的20%），这部分残留的表达可能足以在损伤后维持有害的信号传导。此外，本研究主要关注长期预后指标（如白质损伤程度和运动功能恢复情况），可能忽略了损伤后早期或短暂阶段的继发性损伤反应。目前的研究规模尚不足以明确判断性别是否会影响Bmal1缺陷小鼠的脊髓损伤表型，但在iBmal1-/-和EC-Bmal1-/-品系的雄性和雌性小鼠之间，功能恢复指标并无显著差异（见补充表S2）。综合来看，无论是成年后全细胞层面的Bmal1缺失，还是发育过程中仅针对内皮细胞的Bmal1缺失，都对胸椎脊髓损伤后的白质损伤或功能恢复没有显著影响。这些研究结果表明，Bmal1-/-小鼠中观察到的较轻的脊髓损伤表型，很可能是由发育过程中发生的补偿性基因表达变化所导致的，而且这些变化涉及的内细胞类型并不仅限于内皮细胞。此外，数据还表明，至少在挤压性胸椎脊髓损伤的情况下，药物抑制BMAL1通路不太可能成为一种有效的神经保护策略。