《Talanta Open》：Analytical characterization of collagen-based dietary supplements: current approaches, analytical challenges and metrological perspectives
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近年来，水解胶原蛋白类膳食补充剂市场显著扩张，增加了对能够确保产品质量、真实性和法规合规性的可靠分析方法的需求。然而，由于胶原蛋白衍生材料的结构复杂性、与水解过程和原料来源相关的变异性，以及商业配方中常见多种成分的存在，这些产品的表征仍具挑战性。研究人员已采用
近年来，水解胶原蛋白类膳食补充剂市场显著扩张，增加了对能够确保产品质量、真实性和法规合规性的可靠分析方法的需求。然而，由于胶原蛋白衍生材料的结构复杂性、与水解过程和原料来源相关的变异性，以及商业配方中常见多种成分的存在，这些产品的表征仍具挑战性。研究人员已采用不同分析技术进行氨基酸谱分析、羟脯氨酸（Hyp）测定以及胶原蛋白基材料的整体表征，其中色谱法结合光学和质谱检测系统因其选择性、灵敏度和结构表征能力而脱颖而出。本综述批判性地讨论了应用于胶原蛋白分析的主要分析策略，包括水解程序、衍生化方法、光学检测液相色谱法以及基于LC-MS/MS的方法，重点关注分析验证和计量学方面。还讨论了传统氮基方法、羟脯氨酸（Hyp）测定、氨基酸（AA）谱分析、基质效应以及使用真实商业补充剂基质进行验证的不足等显著局限性。文献中识别出的一个主要差距是缺乏专门为分析复杂商业胶原蛋白补充剂而设计的协调一致、计量学可追溯且经过适当验证的方法。最后，提出了涉及更稳健计量学方法的未来展望，作为提高胶原蛋白类膳食补充剂分析可靠性、可追溯性和表征的补充策略。
论文主体部分总结如下：
**1. 引言**
近年来，公众对健康生活方式的兴趣增长，推动了膳食补充剂市场的扩张，尤其是水解胶原蛋白类补充剂在皮肤、关节和结缔组织健康领域的应用显著增加。胶原蛋白是哺乳动物中主要的结构蛋白，富含甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp），其衍生物如水解胶原蛋白因高溶解性和生物利用度而被广泛应用。然而，巴西等国的研究显示，商业补充剂存在标签蛋白含量与实际不符的问题，以及通过添加低成本氨基酸（AA）人为提高总氮含量的掺假行为（氨基酸掺假），这凸显了基于总氮定量的传统方法（如Kjeldahl法）的局限性。因此，需要选择性、稳健且计量学可靠的分析方法用于质量控制、真实性评估和合规性认定。本综述旨在批判性地评述用于水解胶原蛋白补充剂表征的主要分析方法，特别是色谱和质谱（MS）方法，并讨论分析挑战、验证、计量学可追溯性及结果可靠性。
**2. 水解胶原蛋白与分析挑战**
**2.1. 结构、组成与水解**
胶原蛋白是一种纤维状结构蛋白，富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，至少有28种类型，其中I、II、III、IV、V型在食品和补充剂中最常见。羟脯氨酸（Hyp）因其在胶原蛋白中的高丰度且在其他蛋白质中较少见，被广泛用作胶原蛋白定量的分析标记物。AA谱分析（基于Gly、Pro、Hyp的相对丰度）也用于组成表征。胶原蛋白原料来源多样（牛、猪、禽、鱼），且不同来源的AA组成存在差异。由于天然胶原蛋白水溶性差，需通过酸、碱或酶水解过程获得不同分子量分布的产物（如明胶和水解胶原蛋白），这直接影响最终产品的肽组成和理化性质，从而给AA表征带来显著挑战。
**2.2. 分析复杂性与掺假**
水解胶原蛋白补充剂的分析复杂性源于原料来源、水解程度、分子量分布和肽组成的变化，以及商业配方中赋形剂和活性成分引起的基质效应。传统总蛋白测定方法（如Kjeldahl、Dumas、Bradford、Lowry、BCA法）存在局限性：氮基方法无法区分蛋白质氮与非蛋白质氮，易受氨基酸掺假影响；比色法受蛋白质组成、基质成分等干扰。比较研究表明，氮基方法估算的蛋白质含量与AA分析结果存在显著差异，而AA分析因其特异性，被FAO推荐为蛋白质定量的参考方法。胶原蛋白独特的AA组成（高Gly、Pro、Hyp）使Hyp测定成为间接定量胶原蛋白的常用方法，但该方法依赖于转换因子，且无法提供关于蛋白质来源、肽分布或结构完整性的信息。AA谱分析虽提供更丰富信息，但水解后不同来源胶原蛋白的AA分布相似，且添加游离AA会掩盖真实组成。因此，需要色谱和质谱（MS）等互补方法，液相色谱（LC）与MS联用可同时测定AA并用于真实性评估。然而，现有方法多基于纯化胶原蛋白或标准品，对真实商业配方（如调味、多组分补充剂）的适用性研究不足。
**3. 胶原蛋白分析方法**
**3.1. 经典方法**
传统方法包括分光光度法、流动注射分析（FIA）、毛细管电泳（CE）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和免疫化学测定。分光光度法基于Hyp氧化后与Ehrlich试剂反应显色，操作简单、成本低。FIA方法可实现自动化分析，提高通量。CE方法用于Hyp测定，重现性好。FTIR结合化学计量学可用于预测胶原蛋白含量，但选择性较低。酶联免疫吸附测定（ELISA）可用于评估未变性II型胶原蛋白的抗原表位保留情况，提供水解方法无法获得的结构信息。总体而言，经典方法在分子表征方面有限，尤其对于复杂商业产品，这推动了色谱方法的发展。
**3.2. 氨基酸分析的色谱方法**
色谱方法因高分离能力和灵敏度，是AA分析的主要手段。多数方法需要先进行蛋白质水解，然后进行或不进行柱前衍生化以增强检测能力（紫外UV、二极管阵列检测器DAD、荧光检测器FLD）。图1总结了典型分析流程（此处省略图示）。表1列出了主要色谱方法（此处省略表格）。
**3.2.1. 水解与衍生化**
样品制备中最关键的是水解步骤。酸水解（HCl，105-150°C，1-24h）最常用，但存在时间长、某些AA（如色氨酸）降解等问题。为缩短时间，微波辅助水解和加压水解已成为替代策略。碱水解（如NaOH）较少使用，但可减少某些降解。水解后常需柱前衍生化，常用试剂包括邻苯二甲醛（OPA）、9-芴基甲氧基羰基氯（FMOC-Cl）、异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）和4-氯-7-硝基苯并呋喃（NBD-Cl），以增强UV或荧光检测灵敏度。手性衍生试剂（如R-DBD-PyNCS）可用于D/L氨基酸对映体分离。衍生化虽提高灵敏度，但也引入实验变异性，影响方法重现性。
**3.2.2. 氨基酸的光学检测**
UV、DAD和FLD是常用的光学检测方法。AA定量后获得的谱图（特别是Gly、Pro、Hyp浓度）可用于评估胶原蛋白组成和含量。FLD方法因高灵敏度而常用，如HPLC/UPLC结合AQC、OPA等衍生化试剂。UV/DAD方法成本低、操作简单，如Kr?i?nik等开发的HPLC-UV方法用于商业补充剂质量控制，验证了其特异性、精密度和稳健性。然而，光学检测法选择性有限，依赖保留时间，易受共洗脱和基质干扰，且衍生化增加变异性。不同色谱条件（色谱柱、流动相、梯度）的差异阻碍了方法间的直接比较，但LC-DAD/FLD仍广泛用于常规应用。
**3.3. 色谱-质谱联用方法**
质谱（MS）方法通过质量-电荷比（m/z）提供分子识别和定量信息，串联质谱（MS/MS）通过特征碎片离子进一步确认结构。与光学检测相比，MS/MS选择性更高，降低了共洗脱和基质干扰风险。表2列出了主要MS方法（此处省略表格）。气相色谱-质谱（GC-MS）需衍生化以增加挥发性，用于Pro、Hyp等二级氨基酸分析。液相色谱-质谱（LC-MS）和LC-MS/MS更通用，无需挥发，水解后可不经衍生化直接分析，或如Weber等使用UHPLC-MS/MS结合AQC衍生化同时测定多种AA。Colgrave等采用LC-MS/MS多反应监测（MRM）模式高灵敏度定量Hyp，可区分异亮氨酸等异构体。靶向肽分析方法保留了序列特异性信息，如Gly-Pro-Hyp三肽的测定可区分海洋和陆地胶原蛋白，比单纯Hyp定量更具鉴别能力。基于自下而上蛋白质组学的工作流程可检测物种特异性肽标记，用于真伪鉴别。非靶向高分辨质谱（HRMS）方法（如Orbitrap、QTOF）可全面表征肽谱，发现新生物标记物，但数据处理复杂。这些方法为研究加工对胶原蛋白分子完整性的影响提供了工具，但通常需要更复杂的仪器和专业知识。尽管有这些优势，MS方法仍存在仪器成本高、操作复杂、基质效应影响电离等问题，需要适当的验证和计量学控制。
**4. 计量学方面与分析验证**
随着胶原蛋白补充剂组成复杂性的增加，定义分析量（measurand）是方法开发的基础。可靠的定量依赖于适当的样品处理、水解/酶解、校准和基质效应控制。分析验证应评估选择性、基质效应、线性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）、精密度和准确度等参数。测量不确定度评估和计量学可追溯性日益重要，相关国际标准（ISO/IEC 17025、GUM、Eurachem指南）强调了这些方面。AOAC INTERNATIONAL的SMPR 2016.005为胶原蛋白定量设定了最低性能标准，但尚未采纳官方方法。表4总结了主要验证参数（此处省略表格）。例如，Azilawati等验证的RP-HPLC-FLD方法回收率80-115%，无显著基质效应；Li等采用加压水解将时间从24h缩短至2h，且保持分析等效性；Vatansever等开发的LC-ESI-TOF-MS方法回收率89-98%，适用于II型胶原蛋白定量。Liscio和Hopley开发了基于同位素稀释质谱（IDMS-LC-MS/MS）的Hyp测定方法，实现了高选择性和计量学可追溯性。然而，许多研究仍局限于基本验证参数，缺乏对稳健性、不确定度、基质效应和真实商业基质验证的充分评估。因此，开发选择性好、经过适当验证且计量学可追溯的方法仍是关键需求。
**5. 未来展望**
未来发展方向包括整合协调的分析协议、全面的分子表征和计量学可靠的验证策略。需要协调水解、衍生化和AA测定程序，以改善结果可比性和实验室间重现性。尽管有GME发布的可食用胶原肽测试标准方法，但主要基于传统分光光度法，仍需MS互补方法。色谱-MS方法在真实性和组成表征方面潜力巨大，基于肽谱、分子指纹、HRMS和蛋白质组学的方法正在兴起，并结合化学计量学工具（如主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA）用于胶原蛋白来源鉴别。然而，这些方法仍依赖于光谱数据库、标准化数据处理和进一步验证。加强计量学基础设施（如建立参考测量程序、有证标准物质CRM）将提高分析结果的可靠性和一致性。
**6. 结论**
水解胶原蛋白补充剂市场的持续扩张和产品复杂性强调了开发可靠、选择性和适合目的的分析方法的重要性。传统方法（氮基法、Hyp测定、AA谱分析）在常规应用中仍发挥作用，但在真实性评估、来源鉴别和掺假检测方面存在局限。LC-MS和LC-MS/MS在选择性、结构确认和抗干扰方面具有优势，但许多方法未针对真实商业基质进行验证。基于肽谱、分子指纹、HRMS和蛋白质组学的方法作为补充策略具有潜力，但操作复杂。目前，LC-MS/MS的AA分析在选择性、稳健性和计量学可靠性之间提供了最佳平衡，而HRMS蛋白质组学工作流程则是高级真实性评估的有力工具。
