《Talanta》：Phage display-derived single-chain variable fragment antibody for highly sensitive and specific detection of thiamethoxam residues in food matrices
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摘要噻虫嗪作为一种广泛使用的农药，由于其残留污染可能对食品安全构成威胁，因此亟需高度敏感的检测方法。本研究通过用小鼠免疫并制备出浓度为1.6×1010 PFU/mL的抗体库，进而利用噬菌体展示技术筛选出了能够特异性识别噻虫嗪的可溶性单链变量片段抗体。基于该抗体，研究人员建立了间接
摘要
噻虫嗪作为一种广泛使用的农药，由于其残留污染可能对食品安全构成威胁，因此亟需高度敏感的检测方法。本研究通过用小鼠免疫并制备出浓度为1.6×1010 PFU/mL的抗体库，进而利用噬菌体展示技术筛选出了能够特异性识别噻虫嗪的可溶性单链变量片段抗体。基于该抗体，研究人员建立了间接竞争ELISA法和胶体金免疫层析法。在最优条件下，该ELISA法的IC50值为25.95 ng/mL，线性检测范围为8.13 ng/mL至137.97 ng/mL。此外，该单链变量片段抗体对其他结构相似的神经毒剂也具有较好的特异性。在添加了靶标物质的实际样品中，检测的平均回收率在71.14%至110.49%之间，变异系数为2.22%至7.92%，显示出良好的准确度和精密度。而优化后的胶体金免疫层析法的最低检测浓度为0.06 mg/kg至0.10 mg/kg。这项研究为开发用于检测各类样品中噻虫嗪残留的单链变量片段抗体提供了理论依据和技术支持。
引言
噻虫嗪是一种神经毒类农药，作为昆虫烟碱乙酰胆碱受体的激动剂，能够干扰昆虫的中枢神经系统，从而使其瘫痪或死亡[1]。由于其对多种害虫具有高效杀灭作用，这类农药被广泛用于农作物种植中[2]。然而，它在土壤和水体中的持久性引发了人们对其对非目标生物及食品安全影响的更多研究。长期摄入超过安全标准的噻虫嗪可能对人类健康造成危害[3]。欧洲食品安全局明确指出，神经毒类农药会削弱蜜蜂的飞行能力[4]。2018年，欧盟为保护生态环境和生物多样性，正式禁止在户外使用包括噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉在内的各类神经毒类农药[5]。2019年，联合国粮农组织与世界卫生组织的农药残留联合专家委员会为多种神经毒类农药制定了10-200 μg/kg体重的每日允许摄入量，这一数值代表了不会带来显著健康风险的终生暴露阈值。尽管不同国家和国际组织对噻虫嗪的残留限量规定有所不同，但总体趋势是逐步制定更为严格的限制措施，以减少其对非目标生物和环境的影响。中国规定茶叶中噻虫嗪的最大残留量为10 mg/kg，而日本和美国的限制标准则为20 mg/kg[6]。欧盟还对进口食品和饲料中的噻虫嗪及噻虫胺制定了更低的残留限量：坚果类（山核桃、杏仁、栗子、腰果）中的噻虫嗪最大残留量为0.02 mg/kg，而水果类（樱桃、杏子、榅桲）中的残留量则在0.5至0.7 mg/kg之间[6]。因此，建立快速且灵敏的检测方法对于保障农产品安全和公众健康至关重要。
目前，已有多种基于大型仪器分析技术的经典方法被用于检测噻虫嗪残留，比如液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术以及高效液相色谱技术[7]。液相色谱串联质谱技术也被证明是测定烟草叶和土壤中噻虫嗪含量的有效方法[8,9]。虽然这些方法具备较高的准确度和灵敏度，但它们需要先进的设备、专业的操作人员，而且成本高昂、耗时较长，因此不适合在现场进行快速检测，也不适用于资源有限的地区。基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析法因其简便快捷的特点而受到广泛关注[10]。要提升检测的灵敏度和准确性，就必须不断优化免疫识别元件，同时还需要解决传统抗体（如单克隆抗体和多克隆抗体）制备过程中存在的诸多难题。目前，小分子结构的单克隆抗体和多克隆抗体的制备仍然主要依赖研究人员的经验判断和试错方法，而且这类抗体的结构较为复杂，难以进行改造[11]。此外，传统单克隆抗体和多克隆抗体由于其复杂的四级结构以及对天然构象稳定性的依赖，给基因工程改造带来了很大挑战，同时也更容易出现表达失败或蛋白质聚集的问题[12,13]。因此，尽管已有基于传统抗体的噻虫嗪检测方法，但由于上述固有缺陷，这类方法的广泛应用仍受到限制，这就迫切需要开发出更加可持续、易于工程化改造且重复性更好的识别元件。
基因工程技术为克服这些限制提供了有效的解决方案。在各种工程化抗体中，通过用柔性肽连接子将重链和轻链的变量区域连接起来而制成的单链变量片段抗体，被视为理想的替代方案[14,15]。与传统单克隆抗体和多克隆抗体相比，单链变量片段抗体具有诸多优势：首先，它们可以从噬菌体展示抗体库中快速筛选出来，并且在几周内就能在表达系统中大量生产，完全无需使用动物；其次，作为基因编码的分子，它们不存在批次间的差异，因此能够保证检测结果的一致性；最后，由于体积小且结构模块化，它们很容易通过基因融合或改造来用于开发新的检测方法[[16], [17], [18], [19], [20], [21]]。
本研究利用噬菌体展示技术，从免疫抗体库中筛选出了高亲和力的针对噻虫嗪的单链变量片段抗体。该抗体已在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，研究人员还通过分子对接技术对其结构进行了分析。基于该单链变量片段抗体，研究人员建立了灵敏的ELISA检测平台，该平台在检测蔬菜样本中的噻虫嗪残留方面表现优异。此外，他们还设计了带有胶体金标记的免疫层析试纸条，可用于现场快速检测噻虫嗪，为食品安全监测提供了可靠的工具。
章节节选
材料与试剂
噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、丙溴磷、氟虫腈、霜脲氰的标准溶液均购自中国河南的BWRM有限公司。弗伦兹完全佐剂、弗伦兹不完全佐剂、脱脂奶粉、带有HIS标签的蛋白质纯化试剂盒以及大肠杆菌TG1则购自中国上海的贝赛姆公司。总RNA提取试剂II购自美国诺克罗斯的OMEGA公司。M13KO7辅助噬菌体则购自新英格兰公司。
半抗原与抗原的鉴定
噻虫嗪是一种小分子化合物，虽然具有一定的反应活性，但却不具备免疫原性。若要使其具有免疫原性，就必须将其与某种大分子载体蛋白结合[32]。合理设计免疫原对于在动物体内引发强烈的免疫反应至关重要。由于噻虫嗪没有羧基，因此首先通过β-植酸丙酸与噻虫嗪的缩合反应合成了噻虫嗪半抗原。噻虫嗪半抗原的傅里叶变换红外光谱分析结果如下
结论
本研究成功构建了一个容量大、种类丰富的噻虫嗪特异性单链变量片段抗体噬菌体展示抗体库，从中筛选出了对噻虫嗪具有高亲和力且特异性强的抗体克隆。通过对参与抗原识别的关键氨基酸残基的初步分析，研究人员进一步了解了二者之间的分子相互作用机制，也为未来的抗体工程研究提供了参考。基于所获得的单链变量片段抗体，研究人员开发出了间接竞争ELISA检测方法，该方法的检测效果令人满意
CRediT作者贡献说明
孙佳迪：论文撰写——初稿撰写、方法学部分、实验研究、概念设计。 赖岩：软件应用、定量分析。 马万成：实验研究。 孙玉春：方法学部分。 曹继娟：数据整理。 陈廷航：方法学部分。 高松：数据整理。 季健：定量分析。 孙秀兰：论文撰写——审阅与编辑、项目监督。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何已知的利益冲突，也不存在可能影响本文研究结果的个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFF1101000）、江苏省青蓝工程、大连民族大学的生物技术及生物资源利用重点实验室开放基金、教育部（项目编号：KF2026006）、无锡市青年科技人才扶持计划（编号：TJXD-2025-213）、中国重点高校基础研究基金（编号：JUSRP222001）以及食品安全协同创新中心等机构的支持
Jiadi Sun|Yan Lai|Wancheng Ma|Yuchun Sun|Jijuan Cao|Tinghang Chen|Song Gao|Jian Ji|Xiulan Sun
中国江苏省无锡市214122，江南大学食品科学与技术学院、食品安全国际联合实验室、食品安全与质量控制协同创新中心
