《Talanta》：Production of Monoclonal Antibody against Albendazole and Its Metabolites with Homogeneous Cross-Reactivity and Its Application in Lateral Flow Immunoassay
编辑推荐：
摘要在检测阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮以及阿苯达唑-2-氨基磺酮（统称为阿苯达唑残留物）时，由于抗体交叉反应性的不一致性，可能会导致免疫分析出现假阴性或假阳性结果。为确保检测准确性，制备具有均匀交叉反应性的靶向抗体至关重要。本研究通过引入含有5-(丙基硫基)-1H-苯并[d]咪唑-
摘要
在检测阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮以及阿苯达唑-2-氨基磺酮（统称为阿苯达唑残留物）时，由于抗体交叉反应性的不一致性，可能会导致免疫分析出现假阴性或假阳性结果。为确保检测准确性，制备具有均匀交叉反应性的靶向抗体至关重要。本研究通过引入含有5-(丙基硫基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺活性基团的尿素结构，设计出一种新型半抗原。利用单克隆抗体制备技术，成功获得了广谱单克隆抗体9D9，其对阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮及阿苯达唑-2-氨基磺酮的IC50值分别为0.59、0.98、0.41和1.13纳克/毫升。该抗体能够均匀识别阿苯达唑及其三种代谢物，这得益于CDRL3中的Phe-94残基、CDRH3中的Glu-103残基以及CDRL3中的Ser-97残基，它们分别与含硫侧链、苯环以及苯并咪唑环上的仲胺形成π-烷基键、π-阴离子键和氢键。最终，研究建立了一种快速准确的侧流免疫分析法，用于检测动物源性食品中的阿苯达唑及其三种主要代谢物。
引言
阿苯达唑属于苯并咪唑类广谱驱虫药，被广泛用于预防和治疗人类与动物的寄生虫病[1]、[2]。它在体内会代谢为多种化合物，其中阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮和阿苯达唑-2-氨基磺酮是主要代谢物[3]。阿苯达唑在进入体内后会迅速代谢，其残留物可在牛奶以及肌肉、肝脏、肾脏和脂肪等可食用组织中检测到[4]。由于毒理学研究表明阿苯达唑相关残留物具有胚胎毒性和致畸性，因此引发了全球各国的重视，这类残留物也被列为食品残留监测的重点对象之一。为保障食品安全，监管机构为动物源性食品中的阿苯达唑相关残留物设定了最高残留限量，不过不同地区的标志残留物和受监管残留物的定义存在差异。在欧盟，阿苯达唑相关残留物指阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮及阿苯达唑-2-氨基磺酮的总和，其在牛奶中的限量為100微克/千克，在肌肉和脂肪中为100微克/千克，在肾脏中为500微克/千克，在肝脏中为1000微克/千克[7]。在美国，食品药品监督管理局为作为标志残留物的阿苯达唑-2-氨基磺酮设定了限量，即在肝脏中为200微克/千克，在肌肉中为50微克/千克[8]。在中国，GB 31650-2019标准规定牛奶中的标志残留物为上述四种物质的总和，其最高残留量为100微克/千克；而在可食用组织中，阿苯达唑-2-氨基磺酮被定为标志残留物，其在肌肉和脂肪中的最高残留量为100微克/千克，在肝脏和肾脏中的最高残留量为5000微克/千克[9]。这些监管要求表明，阿苯达唑的残留控制与母体化合物及其主要代谢物都密切相关，这也凸显出开发能够均匀识别阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮及阿苯达唑-2-氨基磺酮的分析方法的重要性，从而更全面地评估动物源性食品中的阿苯达唑相关残留总量。
基于抗原-抗体相互作用的侧流免疫分析法是食品安全领域用于现场筛查的重要方法[10]、[11]。抗体性能往往决定了所建立的免疫分析方法的灵敏度和准确性[12]、[13]。尤其是在需要同时检测易代谢化合物时，对抗体性能的要求更为严格，尤其是其交叉反应性。如果抗体与目标的交叉反应性过低，容易导致假阴性结果；而若交叉反应性过高，则容易产生假阳性结果，进而影响检测的准确性。交叉反应性在40%到150%之间的抗体适合用于检测同系物。然而，在同时检测阿苯达唑及其主要代谢物如阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮和阿苯达唑-2-氨基磺酮时，现有抗体对阿苯达唑亚砜或阿苯达唑-2-氨基磺酮的识别能力较弱，交叉反应性低于10%（见表1），这一局限性可能会影响整体残留物的筛查可靠性，尤其是在样本中存在多种阿苯达唑相关残留物时。
在制备广谱抗体时，半抗原设计策略对于决定抗体的亲和力及交叉反应性起着关键作用[15]、[16]。在半抗原设计过程中，通常需要识别并保留目标分析物共有的结构特征[17]，这样就能针对这些共有结构产生抗体，进而提升其识别能力。对于阿苯达唑相关残留物而言，苯并咪唑骨架和含硫侧链是其共有的或密切相关的结构特征，而各代谢物的末端功能基团则有所不同（见图1A）。因此，在半抗原设计时应当仔细保留这些共有结构特征，以便实现对阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑磺酮及阿苯达唑-2-氨基磺酮的均匀识别。在喹诺酮类广谱抗体的制备研究中也有类似结论，只有当免疫用半抗原保留了目标物质家族中最重要且最具特征性的表位时，才能获得相应的广谱抗体[18]。此外，用于将半抗原与载体蛋白结合的连接位点也会影响暴露的抗原决定簇以及半抗原的构象，进而影响所生成抗体的特异性和交叉反应性[19]。另一个可能影响抗体性能的因素是连接臂的类型。对于目标分子上含有活性功能基团（如氨基、羧基和醛基）的化合物来说，如何保持这些活性基团的电荷分布，是制备高性能抗体的关键。关于MQCA抗体的研究表明，保留目标分子的结构特征和原子电荷分布有助于生成高亲和力抗体。而且，连接臂的设计本身也会显著影响抗体的反应程度以及免疫分析的性能[20]、[21]。因此，合理设计新型半抗原是一种很有前景的策略，既能提升抗体对阿苯达唑-2-氨基磺酮的识别能力，也能实现对阿苯达唑相关残留物更均匀的检测。
本研究通过从5-(丙基硫基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的氨基部分延伸出含有尿素的连接臂，合理设计出一种新型半抗原，以此来避免氨基对苯并咪唑环的电荷影响，进而提升广谱抗体对阿苯达唑-2-氨基磺酮的识别能力。
为深入了解所获得抗体的识别机制，本研究采用了分子建模和对接分析技术。最终，以这种广谱抗体为基础，建立了一种快速且可靠的侧流免疫分析法，用于检测动物源性食品中的阿苯达唑相关残留物。
章节节选
试剂与材料
本研究所需的阿苯达唑（纯度98.0%）、阿苯达唑亚砜（纯度≥98.0%）、阿苯达唑磺酮（纯度≥98.3%）、阿苯达唑-2-氨基磺酮（纯度≥98.0%）、多菌灵（纯度97.0%）、苯来特（纯度99.0%）、芬巴唑（纯度98.0%）、甲苯咪唑（纯度98.0%）、奥芬达唑（纯度99.0%）、5-羟基甲苯咪唑（纯度98.0%）、氧苯达唑（纯度98.0%）以及甲基硫菌灵（纯度95.0%）均购自上海。
半抗原设计与完全抗原的合成
为制备出能够均匀识别阿苯达唑及其三种主要代谢物的抗体，半抗原设计是至关重要的步骤。现有文献中报道的阿苯达唑抗体性能见表1。根据其特性，这些抗体可分为两大类：一类是针对苯并咪唑类化合物的广谱抗体，这类抗体是通过在C-6位置引入活性基团来设计半抗原后获得的。
结论
本研究设计并合成了新型半抗原，用于制备能够均匀识别阿苯达唑及其三种主要代谢物的广谱单克隆抗体9D9。与现有文献中的抗体相比，mAb 9D9在与阿苯达唑-2-氨基磺酮结合时，还能在其游离氨基与CDRL3的Ser-97残基之间形成另外两个氢键，从而提升了其对阿苯达唑-2-氨基磺酮的识别能力，这也是该抗体的一大优势。最终，研究人员以mAb 9D9为基础开发出了基于化学发光的侧流免疫分析方法。
作者贡献说明
郭东方：撰写原文初稿、数据可视化、软件应用、方法设计、实验开展、数据整理。张新宇：撰写原文初稿、数据可视化、结果验证、正式数据分析。李子哲：撰写原文初稿、数据可视化、结果验证、正式数据分析。党梦：负责数据可视化、正式数据分析。毛业轩：负责文章审阅与编辑工作。布通：负责正式数据分析。海丹：负责结果验证、正式数据分析。宋联军：负责研究指导、概念构思。黄贤清：负责实验开展、数据整理
伦理审批与参与同意
实验用雌性Balb/c小鼠来源于郑州华兴实验动物场，由河南省科学技术厅提供（动物实验批准编号SCXK 2019-0002）。本实验方案已获得河南农业大学科学伦理委员会的批准（编号HNND2024031305）。
利益冲突声明
所有作者声明，自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
利益冲突声明
? 所有作者声明，自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了以下机构的资金支持：中国国家自然科学基金（项目编号32472436）、河南省自然科学基金（项目编号252300421161）、河南省高校科技创新人才培育计划（项目编号25HASTIT044），以及河南省研究生教育改革与质量提升项目（项目编号YJS2026YBGZZ23）。
Dongfang Guo|Xinyu Zhang|Zizhe Li|Meng Dang|Yexuan Mao|Tong Bu|Dan Hai|Lianjun Song|Xianqing Huang|Xiya Zhang
河南农业大学食品科学与技术学院食品加工与流通安全控制河南省工程研究中心，中国河南省郑州市农业路63号，邮编450002
