解离方法影响猪扁桃体细胞悬液中的免疫细胞组成

《Frontiers in Immunology》：Dissociation method influences immune cell composition in porcine tonsil cell suspensions

　　

引言：猪扁桃体是位于口咽界面的富含滤泡的次级淋巴器官。在猪（一种主要家畜物种）中，它们作为吸入和摄入病原体的主要屏障，在黏膜免疫中发挥核心作用。尽管其作为众多病原体进入点和储存库的重要性，但驱动猪扁桃体免疫反应的细胞景观仍未被充分定义。方法：作为增进对扁桃体细胞组成理解并推动先进体外模型建立的第一步，研究人员评估了不同组织解离方法如何影响猪扁桃体免疫细胞亚群（包括常见和罕见的先天性和适应性免疫细胞）的相对频率。研究人员研究了机械解离与酶消化方法对扁桃体白细胞分离的影响，特别是涉及生发中心（GC）反应的细胞：T滤泡辅助细胞（Tfh）、生发中心（GC）B细胞和浆细胞，以及髓系亚群。结果：机械解离使总细胞产量增加27%，而酶消化使细胞活力提高21%。在短期储存期间，免疫细胞频率随时间下降，机械解离检测到更高的细胞数量，而酶消化提供更高的活力。机械分离改善了CD172α⁺髓系细胞和Blimp-1⁺IRF-4⁺浆B细胞的检测，而酶消化增加了CD79α⁺ B细胞和ICOS⁺Bcl6⁺ T滤泡辅助细胞（Tfh）的相对频率。令人惊讶的是，与机械分离的细胞相比，酶分离的细胞表现出细胞因子产生受损，并在3D悬滴培养中活力降低。讨论：这些发现表明，机械分离的扁桃体细胞可能更适合用于球体培养。然而，要建立模拟GC反应的稳健3D培养系统，还需要进一步优化。本研究强调了根据具体实验终点定制组织解离策略的重要性。

**猪扁桃体解离方法对免疫细胞组成及功能的影响：一项系统比较研究**

**研究背景与问题**
猪扁桃体是位于口咽界面的富含滤泡的次级淋巴器官，作为吸入和摄入病原体的首要屏障，在黏膜免疫中起核心作用。猪作为重要家畜，其扁桃体不仅是多种病原体（如猪圆环病毒2型、非洲猪瘟病毒、猪链球菌等）的复制场所和慢性储库，也是食物源性病原体（如沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌）的潜在宿主。然而，猪扁桃体免疫细胞组成，尤其是驱动生发中心（GC，germinal center）反应的细胞亚群，仍缺乏系统定义。近年来，基于人扁桃体的复杂细胞培养系统已作为体外平台用于疫苗免疫原性测试和GC反应（GCR，germinal center reaction）建模，但针对家畜物种的类似模型尚属空白，且亟需发展符合3R原则的替代方法。解离方法的选择可能影响细胞组成和功能，但机械解离与酶消化对猪扁桃体免疫细胞的比较研究此前未见报道。因此，本研究旨在评估不同组织解离方法对猪扁桃体免疫细胞相对频率和功能特性的影响，尤其关注GC反应关键细胞（B细胞、Tfh细胞、抗原呈递细胞），为后续建立扁桃体来源的3D长期培养奠定基础。

**研究目的**
系统比较机械解离与酶消化两种方法对猪扁桃体免疫细胞产量、活力、细胞组成（包括常规T细胞、γδT细胞、B细胞、髓系细胞、Tfh细胞、GC B细胞、浆细胞及树突状细胞亚群）以及功能特性（细胞因子产生和3D球体形成能力）的影响，以确定适用于不同下游实验终点（特别是GC反应建模）的最佳解离策略。

**主要技术方法**
本研究样本来源于德国Landshut SBL屠宰场的健康成年猪（至少6月龄，120 kg，商业杂交品种，包括德国长白猪、大白猪和皮特兰猪）。主要技术方法包括：（1）组织学分析：H&E染色和免疫荧光显微镜评估扁桃体滤泡分布；（2）组织解离：机械解离（通过金属筛网研磨）和酶消化（酶混合物含1 mg/mL胶原酶IV、0.18 mg/mL DNAse I、0.125 mg/mL Liberase DH和0.125 mg/mL Liberase TM，37°C孵育1小时）；（3）流式细胞术：多色染色（包括表面、胞内和核内标志物）鉴定免疫细胞亚群，并检测PMA/离子霉素刺激后的TNFα和IFNγ产生；（4）3D培养：悬滴法和悬浮培养形成球体，评估形态和活力。所有比较均采用配对设计（同一扁桃体分半处理）。

**研究结果**
**3.1 猪扁桃体微结构**：通过H&E染色对扁桃体不同区域（中心vs外周、舌侧vs腭侧）的滤泡大小进行定量分析，发现纵向切面中心区域滤泡显著大于外周，横切面舌侧滤泡显著大于腭侧。因此，后续实验统一采用中心区域（从舌侧到腭侧的全切面）以避免采样偏差。

**3.2 组织解离方法的评估**：机械解离比酶消化获得显著更多的细胞（每克组织9.67×10⁷ vs 7.64×10⁷个细胞），而酶消化显著提高细胞活力（95% vs 74.4%）。在4°C储存2天期间，机械解离始终检测到更高细胞数量，但活力随时间下降更明显；酶消化维持较高活力。

**3.3 机械解离增加髓系细胞检测，酶消化富集B细胞**：流式细胞术分析显示，酶消化显著增加B细胞（CD79α⁺）频率，而机械解离显著增加髓系细胞（CD172α⁺）频率。储存期间，常规T细胞和γδT细胞频率受方法影响，但B细胞频率在两种方法下均保持较高水平（>50%）。

**3.4 酶消化改善Tfh细胞检测**：通过CD3⁺γδTCR^-CD4⁺CD45RA^-ICOS⁺Bcl6⁺门控鉴定Tfh细胞，酶消化显著提高其相对频率（28.42% vs 15.54%），且T-bet⁺ Tfh亚群比例也更高（68.84% vs 57.02%）。储存2天后，酶消化组的Tfh频率下降，但机械分离组反而上升。

**3.5 机械解离改善浆细胞和GC B细胞检测**：通过Blimp-1⁺IRF-4⁺鉴定浆细胞，Blimp-1^-IRF-4^-Pax-5⁺鉴定GC B细胞。机械解离显著增加浆细胞频率，GC B细胞也呈增加趋势（未达统计学显著）。

**3.6 机械解离富集树突状细胞和巨噬细胞亚群**：采用猪特异性标志物组合鉴定树突状细胞亚群（cDC1、cDC2、pDC、tDC）和吞噬细胞（单核细胞、巨噬细胞）。机械解离显著增加pDC和滤泡周围巨噬细胞（CD14^-CD163^-CD169⁺）频率，而酶消化显著富集单核细胞（CD14⁺）。此外，酶消化增加MHC-II（SLA-II）平均荧光强度，提示抗原呈递能力或激活状态改变。

**3.7 酶消化抑制T细胞细胞因子反应并降低球体活力**：PMA/离子霉素刺激后，机械分离的常规T细胞产生显著的TNFα和IFNγ，而酶分离的T细胞细胞因子反应受损，且未刺激条件下基线细胞因子表达升高。在3D悬滴培养中，机械分离的细胞形成更大但形状不规则的球体，且活力随时间维持更好；酶消化形成的球体较小但更圆，但活力下降更快。此外，免疫荧光成像显示，球体中T细胞簇被B细胞包围，与天然扁桃体滤泡结构（B细胞中心、T细胞周围）相反。

**讨论与结论**
本研究系统比较了机械解离和酶消化对猪扁桃体免疫细胞组成和功能的影响。结果表明，两种方法各有优劣：酶消化提高细胞活力及Tfh和B细胞频率，但损害T细胞功能反应和3D球体形成能力；机械解离虽降低活力，但增加细胞产量、髓系细胞频率、浆细胞检测，并更好地保留T细胞功能和3D培养适应性。因此，解离方法的选择需根据实验终点权衡：对于功能性和GC相关免疫反应研究，机械解离可能更优；对于需要高活力及富集Tfh/B细胞的应用，酶消化可能合适。此外，储存时间影响细胞组成，且目前3D培养系统尚不能完全再现天然滤泡结构，需要进一步优化刺激条件。本研究为猪扁桃体免疫细胞分离和体外GC反应建模提供了方法学基础，强调了定制解离策略的重要性。

**结论翻译**：总之，这些发现强调，选择组织解离方法需要仔细平衡细胞组成、功能完整性和实际限制。在我们的实验中，两种解离方法均非普遍优越。相反，每种技术根据下游应用显示出不同的优势。酶消化提高了活力以及Tfh和总体B细胞的检测，而机械解离更好地保留了功能性T细胞反应、髓系细胞频率，并支持3D球体形成。因此，对于研究功能性GC相关免疫反应，机械解离可能更可取。建立作为GC反应体外模型的3D培养系统仍需进一步优化和功能验证。