通过减少Ca2+内流而非RRP囊泡来抑制突触输出，在小脑浦肯野细胞末梢的CB2R过表达时变得明显

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Depression of synaptic outputs by reduction of Ca2+ influx, but not RRP vesicles, becomes evident upon CB2R hyper-expression at cerebellar Purkinje cell terminals

　　

突触传递受到神经调质的动态调控。一个充分研究的例子是大麻素受体1型（CB1R）通过减少突触前Ca²⁺内流来抑制神经递质释放。最近，研究人员（用研究人员代替“我们”）发现GPR55通过一种不同于CB1R的机制调节递质释放。然而，大麻素受体2型（CB2R）的突触前作用仍不清楚。在此，研究人员利用已知同时表达CB2R和GPR55且适合从轴突末梢进行直接膜片钳记录的小脑浦肯野细胞（PCs）研究了这一问题。在PC与其靶神经元之间的原始突触上，应用CB2R激动剂不影响突触传递。这种缺乏效应归因于PC远端轴突末梢内源性CB2R极少。外源表达CB2R使得药理学激活能够抑制突触传递。对突触前Ca²⁺电流和末梢膜电容变化的直接电压钳记录表明，CB2R激活减少了突触前Ca²⁺内流，而不影响总可释放囊泡池（RRP），从而通过降低释放概率导致较少的囊泡胞吐。值得注意的是，将CB2R的两个胞内环替换为GPR55的对应序列，使其突触抑制的作用位点从Ca²⁺通道抑制转变为可释放囊泡池的减少，这与GPR55的作用一致。这些发现表明，当CB2R在轴突末梢充分存在时，它像CB1R一样通过减少Ca²⁺内流来抑制递质释放，并提示大麻素受体的胞内环决定了递质释放是通过抑制突触前Ca²⁺通道还是通过减少可释放囊泡池来受到抑制。

**论文解读：CB2R在小脑浦肯野细胞末梢的突触前抑制机制及其与GPR55的差异**

**研究背景与问题**
突触传递受神经调质动态调控，其中大麻素信号是研究热点。大麻素受体1型（CB1R）通过抑制突触前Ca²⁺内流降低释放概率（Pr）从而抑制递质释放，这一机制已由经典量子假说阐明。另一大麻素相关受体GPR55则通过减少可释放囊泡池（RRP）的大小（即N值）调节释放，而不影响Ca²⁺内流。然而，这些机制此前仅在神经元类型间比较，不清楚同一突触末梢内不同大麻素受体能否通过不同突触前机制调控递质释放。小脑浦肯野细胞（PC）因表达GPR55和CB2R（但缺乏CB1R）而成为理想模型。尽管CB2R mRNA在PC中检测到，但传统大麻素受体介导的抑制在PC轴突末梢缺失，而GPR55依赖的抑制明确存在。因此，研究人员提出两个问题：该缺失是否反映CB2R突触前定位不足，以及PC末梢是否存在大麻素受体的特异性分工。该研究发表在《Frontiers in Molecular Neuroscience》。

**研究内容与结论**
研究人员通过急性脑片和原代培养体系，结合外源基因表达（AAV2载体）、直接突触前膜片钳记录、膜电容测量及嵌合受体构建，系统阐明了CB2R在PC突触末梢的功能。结论如下：
1. 内源性CB2R在PC远端轴突末梢几乎不表达，导致传统大麻素激动剂WIN55,212-2（WIN）无法抑制原始PC突触传递；外源表达CB2R后，WIN通过CB2R特异性抑制突触传递。
2. 直接记录突触前Ca²⁺电流和膜电容变化表明，CB2R激活减少Ca²⁺内流，降低囊泡胞吐，但不影响动作电位波形或微小突触后电流，说明抑制仅通过降低Pr实现。
3. 通过改变去极化脉冲时长估计RRP大小，发现CB2R激活虽减慢Ca²⁺电流激活并降低峰值，但50 ms脉冲诱发的膜电容变化（代表RRP）无显著改变，表明CB2R不调节N值。
4. 将CB2R的第二和第三胞内环替换为GPR55对应序列后，嵌合受体激活不再抑制Ca²⁺电流，而是减少RRP大小，与GPR55作用一致，表明胞内环决定受体作用机制。
**意义**：该研究首次在同一突触末梢证明不同大麻素受体通过不同机制（Pr vs. N）调控递质释放，并揭示CB2R突触前定位限制其功能，为理解病理状态下CB2R上调的生理意义提供了基础。

**关键技术方法**
1. **急性脑片与原代培养**：制备Wistar大鼠（P14-21）小脑矢状切片（200 μm），及新生大鼠小脑原代培养（>21天），用于电生理和免疫细胞化学。
2. **基因表达与嵌合受体构建**：利用AAV2载体在培养PC中外源表达CB2R-Venus或GPR55-Venus；通过PCR点突变构建嵌合受体（将CB2R胞内环替换为GPR55对应序列），并通过核显微注射转染PC。
3. **直接突触前膜片钳记录**：在培养PC轴突膨体（bouton）上进行电压钳，同时记录Ca²⁺电流（ICa²⁺）和膜电容变化（ΔCm），评估囊泡胞吐和RRP大小。
4. **免疫细胞化学**：用抗calbindin和抗CB2R抗体标记PC，结合共聚焦显微镜观察CB2R亚细胞分布。

**研究结果**
**1. 缺乏大麻素介导的抑制反映CB2R突触前定位不足**
- 在急性切片中，WIN（300 nM）不改变PC-深部小脑核（DCN）突触的诱发IPSC幅度（0.72±0.14 vs. 0.74±0.14 nA，p=0.423）。
- 在培养中，同样无抑制（363±59 vs. 384±69 pA，p=0.293）。免疫染色显示CB2R免疫反应性在PC胞体和树突，但远端轴突膨体几乎无信号。
- 外源表达CB2R-Venus后，WIN显著抑制IPSC幅度（300±109 vs. 212±83 pA，p=0.0407），该效应被CB2R拮抗剂AM630阻断。

**2. 减少Ca²⁺内流是CB2R介导的突触抑制机制**
- 在CB2R-Venus表达PC的突触前膨体，WIN使ICa²⁺从67±12降至50±9 pA/pF（p=0.0193），ΔCm从26±7降至17±5 fF/pF（p=0.0482）。
- 对照PC（仅EGFP）中WIN无影响。WIN不改变动作电位波形或mIPSC幅度/频率，排除其他机制。

**3. RRP大小对CB2R激活不敏感**
- 通过1-50 ms去极化脉冲刺激，WIN使ICa²⁺激活时间常数从0.77增至1.47 ms（p=0.0481），峰值从101.9降至53.1 pA/pF（p=0.0471）。
- 但50 ms脉冲诱发的ΔCm在WIN前后无显著差异（26±4 vs. 23±4 fF/pF，p=0.651），表明RRP未变。短脉冲下ΔCm降低（p=0.0261，two-way ANOVA），与Ca²⁺电流减少一致。

**4. 替换CB2R胞内环为GPR55序列将作用从降低Pr转为降低N**
- 嵌合受体表达PC中，WIN不影响ICa²⁺激活时间常数（1.40 vs. 1.48 ms，p=0.905）和峰值（74.8 vs. 72.4 pA/pF，p=0.929）。
- 但50 ms脉冲诱发的ΔCm从47±9降至23±5 fF/pF（p=0.0440），拟合显示RRP快速成分减少约一半，类似GPR55效应。

**讨论与结论**
**讨论总结**：本研究揭示缺乏传统大麻素受体介导的抑制主要源于内源性CB2R在PC轴突末梢定位不足，而非受体功能缺陷。当CB2R通过外源表达定位到突触前膨体时，它通过抑制Ca²⁺内流（降低Pr）抑制递质释放，与CB1R机制相似，而与GPR55（降低N）不同。嵌合受体实验表明，受体胞内环决定了这一机制差异，可能涉及不同G蛋白亚型（如G_i/o vs. G_q/12/13）。Pr和N的调节具有不同的功能后果：Pr调节影响初始突触效能和短期可塑性，而N调节影响高频活动下的持续释放能力。在病理条件下（如神经炎症），CB2R上调可能被招募到突触末梢，使同一突触同时具备Pr和N调控能力，扩大动态范围，并可能引入经典内源性大麻素可塑性（如DSI）。
**研究结论翻译**：本研究表明，在PC轴突末梢，传统大麻素受体介导的抑制缺失主要反映内源性CB2R的突触前定位不足；当CB2R定位于突触前膨体时，它通过抑制突触前Ca²⁺内流（降低Pr）而不改变可释放囊泡池（N）来抑制递质释放，这与GPR55的作用机制形成对比。