《International Microbiology》：Hyperin application modulates leaf bacterial communities and reduces tobacco-specific nitrosamines in air-cured Burley tobacco
编辑推荐：
为研究金丝桃苷（hyperin）对白肋烟（Burley tobacco）叶片表面细菌群落多样性和丰富度的影响，研究人员以白肋烟品种‘Eyan 1’为研究材料。在收获前一天，处理组所有叶片喷洒金丝桃苷，对照组所有叶片用纯水处理。分别在收获当天、晾制（air-cu
为研究金丝桃苷（hyperin）对白肋烟（Burley tobacco）叶片表面细菌群落多样性和丰富度的影响，研究人员以白肋烟品种‘Eyan 1’为研究材料。在收获前一天，处理组所有叶片喷洒金丝桃苷，对照组所有叶片用纯水处理。分别在收获当天、晾制（air-curing）两周和四周后采集样品。结果表明，金丝桃苷的施用可能影响白肋烟叶片上细菌群落的多样性和丰富度。研究人员分析了细菌群落结构、共现模式（co-occurrence patterns）和预测代谢通路。金丝桃苷处理与多个属（包括Agrobacterium、Stenotrophomonas和Bacillus）相对丰度的增加相关，这些属此前被认为与氮转化或TSNA（烟草特有亚硝胺，tobacco-specific nitrosamines）降低有关。这些微生物可能有助于在晾制过程中降低TSNA，从而减少白肋烟上部叶中TSNA的积累。本研究结果可为探究金丝桃苷对微生物群落的影响提供证据，并加深对金丝桃苷在白肋烟中调控机制的理解。
**研究背景与问题**
烟草特有亚硝胺（TSNA，tobacco-specific nitrosamines）是烟草生物碱（如尼古丁、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱）发生亚硝化反应的产物，被国际癌症研究机构列为一类致癌物。TSNA主要在烟叶调制（curing）、储存和加工过程中形成，而非在鲜叶中大量存在。在TSNA形成的关键步骤中，硝酸盐还原细菌（nitrate-reducing bacteria）介导的硝酸盐转化为亚硝酸盐是重要的限速环节，该过程为尼古丁等生物碱的亚硝化提供了前体。因此，控制TSNA的积累对于提升烟草安全性至关重要。已有多项研究尝试通过施肥、打顶（topping）时间优化、调制技术改进以及外源化学物质（如维生素C、维生素E）喷施等方法来降低TSNA含量。前期研究人员发现，植物源材料（如荷叶提取物）可显著降低TSNA含量并改善感官品质，但其作用机制尚不明确。金丝桃苷（hyperin）是荷叶提取物的主要成分，推测其可能通过调控叶片表面微生物群落来影响TSNA的积累。
**研究内容**
本研究以白肋烟（Burley tobacco）品种‘Eyan 1’为材料，在湖北崔坝进行田间试验。在收获前一天，对处理组烟叶喷施金丝桃苷，对照组喷施纯水。分别在收获当天、晾制（air-curing）两周和四周后采集叶片样本，分析细菌群落多样性、结构、共现模式和预测功能通路，并检测烟碱和TSNA含量。研究旨在探究金丝桃苷对叶片表面细菌群落的调控作用及其对TSNA积累的影响。
**主要技术方法**
1. **16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA gene amplicon sequencing）**：针对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增，并在Illumina NovaSeq平台测序，以获取叶片表面细菌群落组成信息。
2. **生物信息学分析**：使用QIIME2系统对序列进行聚类，划分操作分类单元（OTU，operational taxonomic units），并基于GREENGENES数据库进行物种注释。通过α多样性指数（Sobs、Shannon、Chao1）和基于加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA，principal coordinates analysis）评估群落多样性和结构差异。
3. **共现网络分析（Co-occurrence network analysis）**：计算优势菌属间的Spearman秩相关系数，构建网络图以揭示群落内部关联模式。
4. **功能预测**：利用PICRUSt2软件基于16S rRNA数据进行KEGG通路（KEGG pathway）功能预测，分析微生物群落代谢潜力。
5. **TSNA与烟碱检测**：采用气相色谱法检测烟碱含量，并依据Morgan等（2014）方法检测NNN、NNK、NAT和NAB四种TSNA组分。
**研究结果**
**金丝桃苷施用降低白肋烟叶TSNA含量**
通过检测晾制后烟叶的烟碱和TSNA含量发现，处理组中上部叶的烟碱含量高于对照组但差异不显著；然而，处理组中上部叶的TSNA含量低于对照组，且上部叶的差异达到显著水平。这表明金丝桃苷可显著降低白肋烟上部叶的TSNA积累。
**白肋烟叶细菌多样性**
共鉴定出对照组307,633个和处理组336,666个细菌OTU。Sobs、Shannon和Chao1指数在处理组中均高于对照组，但差异未达显著水平，说明金丝桃苷可影响细菌群落多样性和丰富度但程度有限。PCoA分析显示，PC1和PC2共同解释了超过70%的细菌群落变异，同一时期的处理组和对照组样本在PC1轴上聚集，但早期（C1和T1）与后期（C2、T2、C3、T3）样本沿PC1轴分离，表明晾制周期对细菌群落的影响大于金丝桃苷的施用。
**白肋烟叶细菌群落结构**
共鉴定出38个细菌门，其中变形菌门（Proteobacteria）为绝对优势菌门（占82.91%~96.61%），放线菌门（Actinobacteria）次之（1.43%~10.25%）。与对照组（C3）相比，处理组（T3）中变形菌门相对丰度降低10.67%，而放线菌门相对丰度增加8.11%，表明金丝桃苷改变了细菌群落结构。属水平Venn图和热图分析显示，样本间共有属和特有属分布存在差异，且T3中19个属（包括Agrobacterium、Stenotrophomonas和Bacillus等）的相对丰度显著高于C3，提示这些菌属可能参与TSNA的降解。
**细菌群落相关性及功能通路预测**
Spearman相关性分析表明，在对照组和T3中，50个优势菌属间存在大量正相关关系，但在处理组中观察到Sphingomonas与9个菌属间的负相关，提示金丝桃苷改变了群落内部互作模式。PICRUSt2功能预测在C3和T3中共识别出399条KEGG通路，其中49条通路在处理组和对照组间存在差异丰度。在T3中丰度更高的37条通路中，5条通路（托品烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成，精氨酸生物合成，氮代谢，GABA能突触，谷氨酸能突触）可能参与烟碱和TSNA的代谢。此外，二甲苯降解和氟苯甲酸降解通路的增强提示处理组细菌群落具有更强的生物降解潜力。
**讨论与结论**
**讨论**
研究人员提出，金丝桃苷可能通过两种途径降低TSNA：一是抑制硝酸盐还原细菌以减少亚硝化前体；二是促进有益菌降解已形成的TSNA。由于处理组中硝酸盐还原细菌（如棒状杆菌、微球菌）丰度无显著变化，而TSNA显著降低，因此支持了第二种假说。金丝桃苷作为黄酮类化合物，可能通过调控植物-微生物互作，富集Agrobacterium、Stenotrophomonas和Bacillus等具有TSNA降解潜力的菌属。这些菌属此前已被证实可通过分离菌株（如Bacillus amyloliquefaciens DA9、Agrobacterium tumefaciens、Stenotrophomonas sp. K18）降低烟叶中TSNA含量。PICRUSt预测的代谢通路变化进一步支持了氮代谢和生物降解途径在TSNA降低中的潜在作用。然而，本研究仅基于16S rRNA扩增子测序，缺乏体外分子验证（如q-PCR）和真菌群落分析，未来需通过宏基因组学或培养组学方法进行验证。
**结论**
金丝桃苷的施用影响了白肋烟叶上的细菌群落多样性和结构，并与Agrobacterium、Stenotrophomonas和Bacillus等多个属相对丰度的增加相关。这些微生物可能有助于在晾制过程中降低TSNA，从而减少上部叶中TSNA的积累。结果表明，金丝桃苷可以调控叶面细菌群落，并间接提升烟叶安全性。本研究为理解金丝桃苷的微生物调控作用提供了科学依据，并支持其作为降低白肋烟中TSNA的天然方法的应用潜力。论文发表在《International Microbiology》。
