副格氏乳杆菌OLL2716促进胃细胞中Ghrelin表达

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Lactobacillus paragasseri OLL2716 Promotes Ghrelin Expression in Gastric Cells

　　

含有副格氏乳杆菌OLL2716（LG21）的酸奶（LG21酸奶）已被报道能改善胃排空延迟并调节自主神经系统（ANS）活动。胃饥饿素（Ghrelin），一种在胃中产生的肽类激素，增强胃动力和胃酸分泌，并调节自主神经功能。本研究探讨了LG21酸奶是否影响胃细胞中与Ghrelin相关的反应。将MKN45细胞（一种人胃腺癌细胞系）用LG21细胞（活菌或热处理）或LG21培养上清液处理，并定量Ghrelin信使RNA（mRNA）表达。LG21细胞和培养上清液均显著增加Ghrelin mRNA表达，表明细菌细胞和代谢物均有贡献。为支持转录数据，在用LG21细胞处理后，额外通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量分泌的Ghrelin，LG21细胞显著增加Ghrelin分泌。LG21酸奶诱导的Ghrelin mRNA增加早于仅用发酵剂菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1255和嗜热链球菌OLS3294制备的酸奶（不含LG21的酸奶）。该效应也因菌株而异：LG21增加Ghrelin mRNA表达，而副格氏乳杆菌模式菌株无显著作用。在MKN45细胞中的额外药理学实验进一步支持了前列腺素E2（PGE₂）–EP4信号通路在该模型中参与Ghrelin反应的可能性。这些发现表明，在此处使用的探索性体外MKN45模型中，LG21酸奶以菌株依赖性方式调节与Ghrelin相关的读数，LG21和发酵剂菌株均有贡献。

**研究背景与问题**
胃饥饿素（Ghrelin）是一种由胃分泌的28氨基酸肽类激素，具有刺激生长激素分泌、增强食欲、促进胃动力和胃酸分泌、调节自主神经系统（ANS）活性等多种功能。副格氏乳杆菌OLL2716（LG21）菌株（此前归类为格氏乳杆菌）在临床试验中显示能改善功能性消化不良患者的餐后饱胀感、健康成人的胃排空延迟，并增强副交感神经活性，同时改善食欲相关指标。这些效应与Ghrelin的已知功能高度重叠，提示LG21可能通过Ghrelin通路发挥作用。然而，LG21酸奶中具体何种成分介导这些效应、以及上游调控机制（例如前列腺素E2（PGE₂）信号是否参与）尚不清楚。本研究旨在利用人胃腺癌细胞系MKN45体外模型，探讨LG21酸奶及相关制备物是否影响Ghrelin相关读数，并探索候选上游信号通路。

**研究内容与结论**
研究人员采用MKN45细胞，分别用LG21细胞（活菌或热处理）、LG21培养上清液、LG21酸奶、不含LG21的酸奶（仅含发酵剂菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1255和嗜热链球菌OLS3294）及其乳清等处理，通过定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测Ghrelin mRNA表达，并利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测分泌型Ghrelin。此外，运用药理学激动剂和拮抗剂探究PGE₂–EP4受体信号的作用。结果显示：LG21细胞（活菌或热处理）及培养上清液均显著上调Ghrelin mRNA表达；LG21酸奶诱导Ghrelin mRNA升高的时间（2小时）早于不含LG21的酸奶（4小时）；乳清实验表明LG21酸奶乳清在6小时显著增加表达，而不含LG21的酸奶乳清效应较弱；三种菌株（OLL1255、OLS3294、LG21）的活菌及培养上清液均能增加Ghrelin mRNA，但LG21在较低菌落形成单位（CFU）下表现出更早的诱导效应；五种发酵乳制品常用模式菌株中，仅德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌显著增加表达，而副格氏乳杆菌模式菌株无显著作用，表明该效应具有菌株依赖性；外源性PGE₂及EP4受体激动剂CAY10598可增加Ghrelin mRNA，EP4受体拮抗剂L-161,982能显著减弱活LG21细胞诱导的升高，支持PGE₂–EP4信号参与。该研究发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》。

**主要关键技术方法**
本研究使用人胃腺癌细胞系MKN45（购自日本人类科学基金会）作为体外模型。关键技术包括：①定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测Ghrelin mRNA及PTGER4 mRNA表达，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，采用ΔΔCt法进行相对定量；②酶联免疫吸附试验（ELISA）定量细胞培养上清中总Ghrelin浓度；③药理学激动剂/拮抗剂实验：分别使用PGE₂（1 μM）、EP2受体激动剂butaprost free acid（1 μM）、EP1/EP3受体激动剂sulprostone（0.1 μM）、EP4受体激动剂CAY10598（0.1 μM）及EP4受体拮抗剂L-161,982（0.1 μM）处理细胞，评估对Ghrelin mRNA表达的影响。所有细菌菌株来源明确：LG21、OLL1255、OLS3294由明治株式会社提供；模式菌株购自日本微生物菌种保藏中心（JCM）。

**研究结果**
**1. Ghrelin mRNA表达与分泌型Ghrelin的相关性**
通过Spearman等级相关分析，在活LG21细胞刺激后2、4、6小时，Ghrelin mRNA表达与分泌型总Ghrelin水平呈正相关（ρ=0.706，95% CI 0.223–0.911，P=0.010），支持将Ghrelin mRNA作为替代读数。

**2. 活菌、热处理菌及培养上清液对Ghrelin表达的影响**
与各自对照相比，活LG21细胞、热处理LG21细胞及LG21培养上清液均显著增加Ghrelin mRNA表达（4小时），表明细菌细胞及其代谢产物均具有活性。

**3. 酸奶对Ghrelin表达的影响**
LG21酸奶在2小时即显著上调Ghrelin mRNA，而不含LG21的酸奶在4小时才达到显著水平。LG21酸奶乳清在6小时显著增加表达，而不含LG21的酸奶乳清效应较弱且未达统计学显著性。未发酵的牛奶和酸奶混合原料对Ghrelin mRNA无影响。

**4. LG21酸奶中乳酸菌对Ghrelin表达的影响**
三种菌株（OLL1255、OLS3294、LG21）的培养上清液在4小时均显著增加Ghrelin mRNA；活菌实验中，LG21和混合菌组在4小时即有显著增加，6小时时所有菌株均显著上调。在相同OD₆₆₀条件下，LG21的CFU最低，但诱导效应更早，提示其单位菌体活性更高。

**5. 发酵乳制品常用菌种模式菌株对Ghrelin表达的影响**
德氏乳杆菌保加利亚亚种JCM 1002和嗜热链球菌JCM 17834在6小时显著增加Ghrelin mRNA，而副格氏乳杆菌JCM 5343、副干酪乳杆菌JCM 8130、两歧双歧杆菌JCM 1255无显著效应，表明该活性具有菌株特异性。

**6. 药理学证据支持PGE₂–EP4信号参与**
外源性PGE₂（1 μM）和EP4激动剂CAY10598（0.1 μM）在30分钟显著增加Ghrelin mRNA；EP4拮抗剂L-161,982（0.1 μM）预处理1小时可显著削弱活LG21细胞（6小时）诱导的Ghrelin mRNA升高，而EP2、EP1/EP3激动剂无显著效应。此外，MKN45细胞中可检测到PTGER4 mRNA。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，本研究在MKN45体外模型中首次证明LG21酸奶可上调Ghrelin mRNA表达，且该效应涉及细菌细胞、代谢产物及发酵剂菌株的协同作用，并具有菌株依赖性。LG21菌株相较于发酵剂菌株表现出更早的诱导效应，可能与LG21在酸性环境中的存活能力及对胃上皮细胞的黏附特性相关。乳清中可能存在的含Ser-X序列肽段或可部分解释乳清的活性，但需进一步验证。药理学实验支持PGE₂–EP4信号通路参与该模型中的Ghrelin上调，但尚需更直接的上游机制研究。研究局限性包括：仅使用MKN45肿瘤细胞系，不能完全代表正常胃组织；仅检测总Ghrelin而未区分酰基化活性形式；未鉴定具体活性成分；未在人体中测定血浆Ghrelin。结论翻译如下：在该探索性体外MKN45模型中，LG21酸奶有助于上调Ghrelin mRNA表达。尽管LG21酸奶中的三种菌株及其培养上清液均能增加表达，但LG21细胞和LG21培养上清液表现出更早的效应，提示添加LG21可更快速地影响该模型中的Ghrelin相关反应。额外的药理学数据进一步支持了PGE₂–EP4信号通路参与该反应的可能性。然而，由于这些发现基于体外MKN45模型和药理学证据，未来需要更直接地确定受体背景，并阐明该通路与正常胃组织及体内生理的相关性。