《Systems Microbiology and Biomanufacturing》：Yeast-derived biomolecule mixtures from wine lees display antimicrobial activity: an integrated bioprocess approach against grapevine pathogens
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葡萄藤干病（Grapevine trunk diseases）威胁可持续葡萄栽培，而酒糟（wine lees）在循环经济框架内仍是一种未充分利用的生物防治相关副产品。研究人员开发了一种综合生物工艺（integrated bioprocess），通过一系列确定的
葡萄藤干病（Grapevine trunk diseases）威胁可持续葡萄栽培，而酒糟（wine lees）在循环经济框架内仍是一种未充分利用的生物防治相关副产品。研究人员开发了一种综合生物工艺（integrated bioprocess），通过一系列确定的单元操作——包括使用酿酒酵母（Saccharomyces）单培养和与非酿酒酵母（non-Saccharomyces）菌株的顺序接种进行发酵设计、超声辅助自溶（ultrasound-assisted autolysis）、酶解（enzymatic hydrolysis）和3 kDa超滤——将酒糟升级为高分子量生物分子混合物（high-molecular-weight biomolecule mixtures, HMW-BM）和低分子量肽富集组分（low-molecular-weight peptide-enriched fractions, LMW-BM）。在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下，针对引起葡萄藤佩特里病（Petri disease）的两种主要病原体——Phaeomoniella chlamydospora 和 Phaeoacremonium minimum——测试了这些产品的抗真菌活性（antifungal activity）。结果表明，高分子量自溶物（high-molecular-weight autolysates）未显示抑制作用。酶解后组分使 Phaeoacremonium minimum 的菌丝生长（mycelial growth）减少45%–75%，使 Phaeomoniella chlamydospora 的菌丝生长减少40%–57%，并分别使分生孢子形成（conidiation）降低高达92%和61%。这些组分还使症状（木质变色，wood discoloration）分别减少47%–52%和35%–73%，使内生真菌生长（endophytic fungal growth）分别减少63%–84%和80%–91%。这些结果表明，酶解与抗真菌活性的出现之间存在关联。采用液相色谱-质谱联用（UHPLC–ESI–TIMS–QTOF）的非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）突出了菌株和发酵依赖性次生代谢物特征（strain- and fermentation-dependent secondary metabolite signatures），其中448个特征（features）在不同发酵条件下存在差异。基于活性相关性指纹图谱（activity-based correlation fingerprinting）鉴定出49个与病原体生长呈负相关的推定生物标志物（putative biomarkers）。总体而言，发酵设计（fermentation design）可作为可控的上游质量参数（upstream quality parameter），为从酿酒厂废弃物（winery waste）中生产抗真菌生物产品（antifungal bioproducts）提供了一条可扩展的循环经济途径。
**论文解读**
**1. 研究背景与意义**
葡萄藤干病（Grapevine Trunk Diseases, GTDs）严重威胁全球葡萄栽培的可持续性，尤其是佩特里病（Petri disease），由子囊菌真菌 Phaeomoniella chlamydospora 和 Phaeoacremonium minimum 引起，导致木质变色、坏死、叶片“虎纹”、生长迟缓甚至植株死亡。由于化学防治措施（如亚砷酸钠）因健康风险被禁用，生物防治成为迫切需求。同时，酒糟（wine lees）作为酿酒工业第二大副产物（约占25%），主要由死酵母细胞组成，富含蛋白质、肽类、多糖等生物活性物质，但在循环经济框架下尚未被充分开发用于植物病原体防治。本研究旨在通过可控的综合生物工艺将酒糟转化为具有抗真菌活性的生物分子混合物，为葡萄藤干病提供新型生物防治策略，并探索发酵设计作为上游质量参数对产物活性的调控作用。该论文发表在《Systems Microbiology and Biomanufacturing》期刊上。
**2. 主要关键技术方法**（不超过250字）
研究人员采用以下关键技术：① 发酵设计：使用两种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株（S1和S3）进行单培养，以及与 Hanseniaspora sp. 菌株（H）的顺序接种混合培养，在实验室葡萄汁培养基（用于体外实验）和三种希腊葡萄品种（Savatiano、Roditis、Moschofilero）的葡萄汁（用于体内实验）中生产酒糟；② 超声辅助自溶与酶解：对酵母生物量进行超声处理促进自溶，随后用 Flavourzyme? 酶解蛋白，再经3 kDa超滤分离获得高分子量生物分子混合物（HMW-BM）和低分子量肽富集组分（LMW-BM）；③ 体外抗真菌活性评价：在PDA培养基中添加10 μg/mL各组分，测量18天后的菌落直径和分生孢子产量；④ 体内植物保护试验：在接种病原体的葡萄藤生根插条（Syrah品种）中，土壤施用LMW-BM混合产物（P1和P2），112天后测量木质变色长度、病原体DNA相对定量（实时荧光定量PCR）、木质素和酚类化合物含量；⑤ 非靶向代谢组学分析：采用UHPLC–ESI–TIMS–QTOF对LMW-BM组分进行数据依赖采集，经MetaboScape和MetaboAnalyst处理，通过ANOVA和相关性分析筛选与病原体生长呈负相关的推定生物标志物，依据Sumner四水平框架进行注释。
**3. 研究结果**
**3.1 酒精发酵与酒糟生产**
通过监测CO?释放和酵母活菌种群动态，所有发酵方案均成功完成，单培养发酵时间短于混合培养，非酿酒酵母在早期占优势后被酿酒酵母取代，但总生物量产量无显著差异（16.3%–19.8% w/v），表明混合培养产生的酒糟化学成分可能不同。
**3.2 高分子量和低分子量生物分子混合物对真菌生长的影响**
体外实验表明，HMW-BM混合物对两种病原体均无抑制效果。而所有LMW-BM混合物均显著减少菌丝生长：对 Phaeoacremonium minimum 的抑制率为45%–75%，对 Phaeomoniella chlamydospora 为40%–57%，其中S3H混合培养产物效果最强（分别为75%和57%）。
**3.3 高分子量和低分子量生物分子混合物对真菌孢子形成的影响**
HMW-BM不影响分生孢子产量。LMW-BM混合物显著降低孢子形成：对 Phaeoacremonium minimum 的抑制率为52%–92%（S3H效果最佳），对 Phaeomoniella chlamydospora 为43%–61%（S3H效果最佳），但S1混合物对前者的抑制不显著，S1H混合物对后者的抑制不显著。
**3.4 P1和P2产品的植物保护效果及内生真菌生长限制**
体内实验中，LMW-BM混合产物P1（单培养来源）和P2（混合培养来源）均显著减少木质变色长度：对 Phaeoacremonium minimum 分别减少47%和52%，对 Phaeomoniella chlamydospora 分别减少35%和73%。病原体DNA相对定量显示，P1和P2分别使 Phaeoacremonium minimum 的DNA减少63%和84%，使 Phaeomoniella chlamydospora 的DNA减少80%和91%。
**3.5 木质素和酚类化合物定量**
与对照组相比，处理组植物木质素和细胞壁结合及可溶性酚类化合物含量无统计学差异，表明LMW-BM混合物未通过激活木质化或酚类代谢途径诱导植物防御。
**3.6 代谢组学分析**
**全局代谢组指纹图谱与发酵依赖性变异**：PCA显示主成分1（PC1）区分混合培养（LMW-BM S1H和S3H）与单培养（S1和S3），主成分2（PC2）分离不同酿酒酵母菌株（S1与S3）。**单培养与混合培养的差异代谢物谱**：热图显示单培养与混合培养组间存在明显分离，混合培养是主导因素。**统计判别与相关性生物标志物筛选**：ANOVA（P<0.05，FDR<0.05）鉴定出448个显著差异特征，其中单培养中两菌株差异153个特征，而混合培养中仅8个，表明共发酵减少菌株间代谢组差异。基于与病原体生长的Pearson相关系数（r<-0.3），筛选出49个推定生物标志物，其中53.1%为肽相关化合物（1个水平1化合物：谷氨酰苯丙氨酸；19个水平2二肽和三肽；6个水平3肽类化合物；其余为脯氨酸和22个未知物）。**推定抗真菌代谢物的理化性质**：这些低分子量化合物在pH 7.4时净电荷为-1至+0.5，等电点（pI）3.8–7.1，疏水性低，极性中等。**推定生物活性分子的结构注释**：以二肽Ala-Phe（丙氨酰苯丙氨酸）为例，其相对丰度在S1H中最高，MS/MS谱图确认序列。三肽Ile-Ala-Ala（异亮氨酰-丙氨酰-丙氨酸）与两种病原体的菌丝生长和分生孢子形成呈最强负相关（r分别为-0.54、-0.42和-0.46），成为优先候选化合物。
**4. 讨论与结论总结**
讨论部分指出，HMW-BM无活性而LMW-BM有活性，表明酶解是释放抗真菌活性的关键步骤；游离α-氨基氮（FAN）浓度与活性无直接关联，提示活性取决于低分子量组分的定性组成。肽类理化性质（低净电荷、低疏水性）可能通过“地毯”或“电穿孔”模型与真菌膜相互作用，或通过抑制细胞壁合成、螯合金属离子、诱导氧化应激、破坏生物膜等机制发挥作用。体内实验证实LMW-BM可减少症状和病原体定植，但木质素和酚类定量未显示植物防御激活。代谢组学显示菌株和发酵依赖性差异，混合培养下调多数肽类特征，表明酿酒酵母与Hanseniaspora sp.的相互作用重塑代谢组。三肽Ile-Ala-Ala作为最强负相关生物标志物，值得未来分离验证。
**结论翻译**：本研究表明，经过精心管理的综合生物工艺可将酒糟（一种丰富的酿酒厂废弃物）转化为具有显著抗真菌活性的生物活性组分，对主要葡萄藤病原体有效。高分子量自溶物缺乏活性，而所有低分子量组分均持续抑制 Phaeomoniella chlamydospora 和 Phaeoacremonium minimum 的菌丝生长和分生孢子形成，突出了酶解和膜分级作为生成低分子量抗微生物活性组分（如肽类）的重要步骤。除体外发现外，体内植物保护试验证实，土壤施用低分子量混合产物可显著减少木质变色并限制内生病原体在葡萄藤生根插条中的定植。尽管如此，还需开展田间试验以评估产品在野外条件下的有效性和稳定性。非靶向UHPLC–ESI–TIMS–QTOF代谢组学提供了活性关联指纹图谱，表明所观察到的抗真菌活性可能受菌株和发酵依赖性低分子量代谢物谱（包括肽类化合物）影响。在此谱中，三肽Ile-Ala-Ala作为与病原体生长呈最强负相关的推定生物标志物，是未来分离和生物测定验证的优先候选物，但其因果作用仍有待实验确认。这些结果表明，发酵设计可作为可扩展的循环经济导向的增值过程中的可控上游质量因素。未来研究应探索鉴定化合物间的协同效应，提高结构-活性理解，并评估田间应用，以促进可持续葡萄栽培实践的采纳。
