《Tree Genetics & Genomes》：Haplotype phasing of de novo chromosome-level assembly of ‘Antonovka’ facilitated the identification of candidate genes for apple scab resistance
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质量提升的Malus基因组资源正成为候选基因鉴定与功能验证不可或缺的一部分。此前研究人员发布了源自具抗病与逆境耐受特性的‘Antonovka’群体的‘Antonovka’ 172670B Malus domestica栽培种的基于参考基因组的定相染色体水平基因
质量提升的Malus基因组资源正成为候选基因鉴定与功能验证不可或缺的一部分。此前研究人员发布了源自具抗病与逆境耐受特性的‘Antonovka’群体的‘Antonovka’ 172670B Malus domestica栽培种的基于参考基因组的定相染色体水平基因组组装。然而，基于参考的组装在沿延伸基因组位点鉴定候选等位基因时精度有限，因为这些区域可能含有来自不同单倍型的重叠群（contig）。本研究提供‘Antonovka’ 172670B基因组的改进高质量版本。该组装通过整合染色体构象捕获（Hi-C）测序与亲本SNP数据分箱（binning）分别实现de novo脚手架化与伪染色体向单倍型的组装后定相，因而完全定相。其质量评分与完整性分别为59.8与96.7%。在两个单倍组（haplome）间共鉴定21,740个大于50 bp的结构变异（SV）及超300万SNP，可进一步用于遗传定位研究。该组装在单倍型1连锁群1上Rvi6连锁标记Ch-Vf1的延伸侧翼区鉴定出苹果黑星病抗性新候选等位基因。这些等位基因具激酶与转移酶活性，其中与HcrVf黑星病抗性基因高度同源者在Venturia inaequalis接种后呈现3.6至8.3倍上调，成为未来‘Antonovka’黑星病抗性功能验证研究的首要候选。
研究背景与立项依据
苹果属（Malus）基因组一半以上由重复元件构成且杂合度较高，传统基于参考基因组的定相组装在延伸位点易混杂不同单倍型重叠群，导致候选等位基因指派错误。‘Antonovka’ 172670B作为抗黑星病（由Venturia inaequalis引起）及非生物胁迫耐受的核心种质，其连锁群1（LG1）上的Rvi17抗性区与已知Rvi6（Vf）位点紧邻但遗传基础未明。研究人员此前发布的参考基制定相版本无法在兆碱基尺度准确区分双亲单倍型，故需整合de novo脚手架与亲本SNP阵列（SNP array）分箱实现真正单倍型解析（haplotype-resolved）染色体水平组装，以精确定位LG1抗性等位基因。该研究发表于《Tree Genetics & Genomes》，为苹果抗病育种提供高置信基因组锚点。
主要技术方法概括
研究人员以已有PacBio HiFi读段（26×）结合新产Illumina Hi-C配对端读段（173百万条）为输入，用hifiasm v0.16.1整合Hi-C进行单倍型解析重叠群组装，经MitoHiFi剔除质体、FCS-GX去污染；Juicer+3D-DNA脚手架为伪染色体并在Juicebox手动编辑；利用20K SNP阵列中‘Antonovka OB’（假定亲本）的分阶段基因型谱，通过BLAST比对SNP探针与R脚本分箱将伪染色体指派为母本/父本单倍型；重复注释用EDTA+RepeatModeler+RepeatMasker，基因注释用BRAKER3联合Gala等RNA-seq与OrthoDB蛋白证据，Merqury/BUSCO评估；结构变异用minimap2+SyrI；LG1区段采用Honeycrisp/Gala共线比对；接种Vi-18–019分离株后取接种前与2 dpi叶片，qRT-PCR验证HcrVf同源基因表达。样本队列含‘Antonovka’172670B、‘Honeycrisp’、‘Florina’、‘Gala’嫁接于M9根砧的温室植株各20重复。
研究结果
Haplotype-resolved chromosome-scale assemblies of M. domestica Antonovka 172670B
基因组大小估算单倍型约688 Mb，杂合率0.94%；两单倍型伪染色体N50均约1.279 Mb，gap数879与809；Merqury质量59.8、BUSCO完整性96.7%；与‘Antonovka OB’SNP等位比对亲代错误率0.3%，证实亲子关系并成功将OB单倍型归并至172670B单倍型1，单倍型2归为未知父本来源。
Repeat annotation, genome masking, gene annotation and identification of structural variants
EDTA建库注释重复，BRAKER3预测基因；两单倍组间鉴定21,740个>50 bp SV与3,014,892 SNP；SV热点窗口富集防御响应与激酶活性过程（agriGO SEA）。
Synteny analysis and identification of candidate scab resistance genes within the LG1 resistance locus
以Ch-Vf1（137 bp抗性等位）为中心、MdExp7–NzMs1为边界比对Honeycrisp单倍型1、Gala单倍型1及172670B单倍型1；在172670B单倍型1侧翼鉴定多个具激酶/转移酶结构域且与HcrVf2高度同源的新候选基因，SnpEff显示非同义置换集中。
Inoculation experiment and expression analysis of known candidate scab resistance genes
172670B、Honeycrisp、Florina表型抗病，Gala感病；qRT-PCR显示172670B单倍型1中HcrVf同源基因在接种2 dpi相对非接种上调3.6–8.3倍，Honeycrisp同源基因亦有诱导，Gala无显著变化。
讨论与结论翻译
讨论指出，完全定相的de novo染色体水平组装消除了参考偏移与跨单倍型重叠群混杂，使LG1上Rvi17区段候选基因可在单倍型语境下被可信缩小；亲本SNP阵列分箱策略可为无 trio 数据的多年生无性繁殖作物提供通用定相校正框架。结论部分：研究人员提供了‘Antonovka’172670B的de novo单倍型解析染色体水平基因组，质量与完整性优于前版；两单倍组间SV与SNP目录为苹果属遗传作图提供资源；在Rvi6标记Ch-Vf1延伸侧翼发现具激酶/转移酶活性、与HcrVf同源且接种后3.6–8.3倍上调的候选等位基因，列为‘Antonovka’黑星病抗性功能验证首选目标。
