海藻糖结晶对冻干制剂中蛋白质聚集影响的研究

《AAPS Open》：Investigating the impact of trehalose crystallization on protein aggregation in lyophilized formulations

　　

海藻糖是一种常用的冻干保护剂，用于稳定冻干制剂中的蛋白质。其物理状态在维持蛋白质的物理和化学稳定性方面起着关键作用。在本研究中，研究人员研究了三种类型的蛋白质/海藻糖系统，以了解海藻糖结晶对冻干状态下蛋白质聚集的影响。这三个系统包括BSA60（约含60%牛血清白蛋白（BSA）单体和40%聚集体）、BSA95（约含95%单体和5%聚集体）以及单克隆抗体（mAb）（聚集很少（<1%））。每个系统均与海藻糖配制，并采用不同的退火持续时间进行冻干。在BSA60制剂中，退火24小时后海藻糖结晶，而BSA95和mAb制剂需要退火72小时才能诱导结晶。尽管在冻干后的24小时退火BSA60样品中存在结晶海藻糖，但在储存过程中未观察到额外的聚集。相反，在BSA95和mAb制剂中，冻干后也观察到结晶海藻糖，在50°C储存期间所有时间点（1个月至12个月）均出现单体损失。总体而言，这些结果表明，在典型的冻干条件下，海藻糖结晶通常不会发生，通常需要长时间的退火和高海藻糖与蛋白质的比例。当结晶确实发生时，会导致不均匀性（如固态核磁共振波谱（ssNMR）所示），从而降低蛋白质在基质中的稳定性。

**论文解读：海藻糖结晶对冻干制剂中蛋白质聚集的影响**

**研究背景与问题**

蛋白质制剂在液态下常因不稳定而需冻干处理以延长储存期。冻干过程包括冷冻、一次干燥和二次干燥，其间可插入退火步骤以促进冰晶或辅料结晶。常用保护剂如海藻糖等二糖通过水替代理论和玻璃化理论稳定蛋白质，其有效性依赖于体系均匀混合且基质保持玻璃态。然而，当海藻糖结晶时，可能导致相分离，形成富海藻糖和富蛋白质区域，破坏蛋白质-辅料相互作用，从而引发稳定性问题。此前研究虽观察到海藻糖在冻干过程中可瞬时结晶，但其对蛋白质长期稳定性的影响尚未明确。本研究旨在探讨海藻糖部分结晶对冻干蛋白质制剂长期稳定性的影响，并利用固态核磁共振（ssNMR）评估分子迁移率和均匀性。

**研究内容与结论**

研究人员选用三种蛋白质/海藻糖体系：BSA60（含约60%单体及40%聚集体）、BSA95（含约95%单体及5%聚集体）和单克隆抗体（mAb，聚集<1%），分别以不同海藻糖比例配制，并在?15°C下退火0、2、4、12、24或72小时，随后冻干。通过粉末X射线衍射（PXRD）检测结晶，尺寸排阻色谱（SEC）监测单体含量变化，ssNMR（¹H T₁弛豫时间）评估分子迁移率和均匀性。结果表明：海藻糖在典型冻干条件下通常不结晶，需长时间退火（BSA60需24小时，BSA95和mAb需72小时）及高海藻糖/蛋白质比才能诱导结晶。结晶发生后，ssNMR显示蛋白质与海藻糖的¹H T₁值差异增大，表明体系不均匀。在50°C储存12个月期间，BSA60制剂（含高聚集体）即使出现结晶也未发生额外聚集；而BSA95和mAb制剂（以单体为主）在结晶后出现显著单体损失。该研究发表在《AAPS Open》。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术：粉末X射线衍射（PXRD）用于检测冻干样品中海藻糖的结晶状态；尺寸排阻色谱（SEC）用于量化蛋白质单体及聚集体含量变化；固态核磁共振（ssNMR）测量¹H T₁弛豫时间，以评估分子迁移率和组分均匀性。样本来源：BSA购自Fisher Scientific（Waltham, MA）和Sigma-Aldrich（St. Louis, MO），mAb由Merck & Co., Inc.（Rahway, NJ, USA）提供。

**研究结果**

**BSA60海藻糖制剂**：PXRD显示，退火24小时后，多数BSA60制剂（除30BSA60_70海藻糖外）出现海藻糖二水合物结晶峰，且峰强度随海藻糖含量增加。ssNMR中，非退火样品中BSA60与海藻糖的¹H T₁值相近，表明均匀混合；退火24小时后两者值差异增大，提示不均匀。SEC结果显示，在50°C储存12个月期间，所有BSA60制剂的单体含量基本保持不变，仅30BSA60_70海藻糖样品在退火4小时以上时出现轻微单体损失。这表明BSA60的预存聚集体可能稳定了单体，海藻糖结晶未显著影响其稳定性。

**BSA95海藻糖制剂**：PXRD表明，退火24小时无结晶峰，退火72小时后所有制剂（除30BSA95_70海藻糖外）均出现结晶峰，且峰强度随海藻糖含量增加。SEC监测3个月发现，退火24小时制剂单体损失极小；退火72小时制剂（尤其高海藻糖含量）出现显著单体损失，且单体损失随蛋白质浓度增加而减小。这说明海藻糖结晶对BSA95稳定性具有负面影响，且高海藻糖/蛋白质比下结晶更易导致不稳定。

**mAb海藻糖制剂**：PXRD显示，退火24小时无结晶，退火72小时后所有制剂（除30mAb_70海藻糖外）均出现结晶峰，且强度随海藻糖含量增加。ssNMR中，退火24小时样品中mAb与海藻糖的¹H T₁值相近，退火72小时间值差异增大，且mAb的¹H T₁值降低，表明有效海藻糖比例下降。SEC结果显示，退火24小时制剂在储存6个月期间聚集水平低（<1%）；退火72小时制剂在1个月内即出现显著聚集增加，且持续至12个月。这表明海藻糖结晶严重破坏了mAb的稳定性，可能是由于结晶表面促进蛋白质展开或减少了保护性无定形海藻糖。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，海藻糖结晶在典型冻干条件下难以实现，需长时间退火和高海藻糖比。结晶导致体系不均匀，ssNMR检测到的¹H T₁值差异可作为早期预警。三种蛋白质体系的比较表明，蛋白质聚集状态影响结晶动力学：预存聚集体可能稳定单体，而单体为主的蛋白质对结晶更敏感。结论部分翻译如下：本研究表明，在典型加工条件下，冻干过程中海藻糖结晶难以实现，通常需要长时间退火和高海藻糖/蛋白质比。当结晶发生时，会导致不均匀性（如ssNMR所示），通过破坏关键的蛋白质-辅料相互作用而损害蛋白质稳定性。BSA60、BSA95和mAb制剂间的比较突显了蛋白质聚集状态和制剂组成影响海藻糖结晶的可能性及失稳程度。最后，ssNMR测量的¹H T₁弛豫时间提供了对不均匀性和长期稳定性的早期预测性见解，强调了其作为制剂筛选和优化工具的价值。