溶酶体通道TPC2调控脉络膜血管新生中的小胶质细胞-内皮细胞信号

《Angiogenesis》：Lysosomal channel TPC2 modulates microglia-endothelial signaling in choroidal angiogenesis

　　

病理性脉络膜新生血管是新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）中视力丧失的基础，但协调血管和免疫组分的分子调控因子尚未完全阐明。在此，研究人员研究了内溶酶体阳离子通道双孔通道2（TPC2）在脉络膜血管新生中的作用。小鼠中TPC2的缺失显著减少了离体脉络膜芽生，而药理学激活则增强了血管生长。机制上，Tpc2缺陷导致多个小胶质细胞来源的促血管生成因子的下调，并削弱了小胶质细胞分泌组刺激新生血管形成的能力。在脉络膜血管细胞中，TPC2缺失减弱了NF-κB/MAPK信号通路。Tpc2缺陷还与组织蛋白酶（尤其是CTSD）的溶酶体分泌相关，导致细胞外蛋白水解活性降低和血管新生的旁分泌调控受损。将这些发现扩展到人类细胞，iPSC来源的内皮细胞中TPC2敲除损害了迁移、管形成和分泌组中的CTSD活性，反映了小鼠表型。总之，这些结果确立了TPC2作为溶酶体介导的脉络膜血管新生的调控因子之一，突出了其作为nAMD治疗靶点的潜力。

**研究背景与问题**
年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球老年人不可逆视力丧失的主要原因，其中新生血管性AMD（nAMD）以病理性脉络膜新生血管（CNV）为特征，导致异常血管从脉络膜突破Bruch膜进入视网膜下腔，引发渗出、出血和纤维化。当前抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法虽能改善视力，但存在不完全应答、地理萎缩进展和长期纤维化等局限，亟需探索超越经典VEGF信号的新分子调控因子。已有研究表明，溶酶体阳离子通道TPC2在血管新生和炎症中均发挥关键作用：TPC2通过NAADP和PI(3,5)P₂激活，调控Ca²⁺和Na⁺跨膜流动，参与自噬、胞吐等过程，并在内皮细胞迁移和免疫细胞激活中具有功能。然而，TPC2在视网膜小胶质细胞与脉络膜血管细胞交互中的具体机制尚不明确。本研究旨在阐明TPC2在nAMD中调控小胶质细胞-内皮细胞信号的作用，为nAMD提供新的治疗靶点。论文发表在《Angiogenesis》。

**研究人员开展的研究与结论**
研究人员通过基因敲除小鼠模型、离体脉络膜芽生实验、蛋白质组学分析、药理学干预及人iPSC来源内皮细胞模型，系统揭示了TPC2在脉络膜血管新生中的调控作用。结论：TPC2缺失通过减少小胶质细胞分泌促血管生成因子（如CHIL3、TGF-β1、HDGF），并削弱脉络膜血管细胞的NF-κB/MAPK信号响应，同时降低溶酶体组织蛋白酶（尤其是CTSD）的分泌与活性，从而抑制脉络膜新生血管。该研究确立TPC2为溶酶体介导的脉络膜血管新生的关键调控因子，提示其作为nAMD治疗靶点的潜力。

**主要关键技术方法**
研究采用了以下关键技术方法：1）离体脉络膜芽生实验：从小鼠（WT C57BL/6J和Tpc2^?/?）后极部RPE/脉络膜/巩膜复合体获取组织块，嵌入基质胶中培养6天，量化芽生面积。2）蛋白质组学分析：利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合数据非依赖性采集（DIA）模式，分析原代视网膜小胶质细胞和脉络膜血管细胞的裂解液及分泌组。3）CRISPR-Cas9基因编辑：通过sgRNA设计、核转染或AAV递送系统，在原代脉络膜血管细胞、视网膜小胶质细胞及人iPSC中实现TPC2敲除。4）人iPSC来源内皮细胞分化：采用逐步诱导协议（来自Luo et al.），从WT和TPC2^?/? iPSC分化出内皮细胞，并用溶酶体膜片钳记录验证功能缺失。样本来源：小鼠（WT和Tpc2^?/?，C57BL/6J背景）及人iPSC系（B7-TetOn-ETV2.2）。

**研究结果**
**Tpc2缺失下调视网膜小胶质细胞中的促血管生成因子**
通过原代视网膜小胶质细胞（pRMG）培养和流式细胞术验证纯度（>85% CD45⁺CD11b⁺），蛋白质组学分析显示Tpc2^?/? pRMG中多种促血管生成因子（如CHIL3、TGF-β1、HDGF）表达下调，且分泌组中694种蛋白仅在WT中检测到，而Tpc2^?/?仅15种，表明TPC2缺失影响小胶质细胞分泌功能。Western blot和免疫荧光进一步证实CHIL3在Tpc2^?/?中几乎不可检测。

**TPC2缺失影响脉络膜血管细胞的血管生成信号响应**
离体脉络膜芽生实验显示，Tpc2^?/?外植体芽生面积显著减少，而外源性CHIL3（200 ng/mL）可增强WT外植体芽生，但无法挽救Tpc2^?/?缺陷。在VEGF和CHIL3刺激下，Tpc2^?/?脉络膜血管细胞中NF-κB、ERK1/2和P38 MAPK的磷酸化水平降低，且无法被有效激活。此外，WT小胶质细胞条件培养基可诱导脉络膜血管细胞中Il6表达及溶酶体、细胞骨架相关蛋白上调，而Tpc2^?/?条件培养基效果减弱。

**TPC2调控溶酶体组织蛋白酶介导的脉络膜新生血管**
药理学抑制（SG-094）减少芽生，激活（A1P）增强芽生。培养基交换实验表明，WT外植体培养基可部分挽救Tpc2^?/?芽生缺陷。蛋白质组学显示Tpc2^?/?脉络膜血管细胞分泌组中组织蛋白酶家族（CTSA、CTSC、CTSD等）显著下调，CTSD活性在脉络膜/RPE裂解液、芽生实验上清和细胞培养上清中分别降低56%、25%和28%。

**Tpc2敲除损害脉络膜血管细胞的血管生成能力**
通过CRISPR-Cas9核转染原代脉络膜血管细胞，Tpc2 mRNA和下游溶酶体基因（Ctsa、Ctsc、Ctsd）表达降低，管形成实验中主管数量减少。AAV介导的Tpc2敲除在视网膜小胶质细胞中实现54.5%的敲除效率，并伴随CHIL3蛋白下降16.8%。

**iPSC来源内皮细胞中TPC2敲除导致血管生成能力受损**
人iPSC中TPC2敲除后，分化内皮细胞（iEC）表达内皮标志物，但溶酶体膜片钳记录无TPC2电流。伤口愈合实验显示TPC2^?/? iEC迁移能力显著降低（24小时残余面积58% vs. WT 8.33%），管形成中主连接数减少70-80%，CTSD活性下降约10%。

**总结与讨论**
本研究揭示了TPC2在脉络膜血管新生中作为小胶质细胞-内皮细胞信号枢纽的作用。TPC2缺失通过双重机制抑制血管新生：一方面减少小胶质细胞分泌促血管生成因子，减弱脉络膜内皮细胞的NF-κB/MAPK信号响应；另一方面降低内皮细胞溶酶体组织蛋白酶分泌，影响细胞外基质重塑。结论部分翻译如下：
**结论**
研究结果提供了机制性见解，确定TPC2为脉络膜血管新生中小胶质细胞-内皮细胞信号的重要调控因子（图7）。TPC2缺失减少小胶质细胞促血管生成因子的分泌，进而减弱脉络膜内皮细胞中NF-κB和MAPK信号响应，从而抑制新生血管形成。同时，TPC2调控内皮细胞溶酶体功能和蛋白酶分泌，可能影响细胞外基质重塑。总之，本研究提示TPC2是nAMD的潜在治疗靶点。