含精油调味空气吸入器在气液界面分化的人鼻上皮细胞中的体外毒性效应

《Archives of Toxicology》：Toxic in vitro effects of flavoured-air inhalers containing essential oils in differentiated human nasal epithelial cells at air–liquid interface

　　

含有精油的调味空气吸入器被营销为安全、天然的吸烟和电子烟替代品，但其潜在的呼吸道毒性实际上仍未得到检验。制造商声称基于“100%天然”成分的安全性，尽管有证据表明吸入精油可导致不良呼吸道效应。研究人员的目的是评估六种市售调味空气产品对人鼻气道上皮细胞的体外毒性。来自八名健康成人的原代鼻气道上皮细胞的分化气液界面（air–liquid interface, ALI）培养物被暴露于空气（对照）或来自三种设备（Füm、Lio、Cigtrus；每种两种口味）的调味空气，该空气是通过以1 L/min的连续气流将空气抽吸通过精油注入芯体一小时进入1000 mL暴露室产生的。结局指标包括跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）、细胞毒性、蛋白质释放、细胞因子/趋化因子（cytokine/chemokine）谱分析和组织学评估。化学分析表征了设备芯体的化学成分，并鉴定了六种产品中的29种化合物，包括可能的致癌物pulegone和细胞毒性cinnamaldehyde。六种口味中的五种显著降低了跨上皮电阻（TEER），表明上皮屏障完整性受损。介质反应是区室特异性的：顶端表面主要显示促炎性谱，而基底部的释放则普遍受到抑制。组织学分析显示，在多个处理中，纤毛覆盖率降低、产黏液细胞减少、上皮厚度减小。该研究表明，一次一小时的调味空气蒸汽暴露即可导致健康人鼻气道上皮细胞的上皮屏障功能障碍、免疫失调和结构损伤，这与制造商的安全声明相矛盾。迫切需要对这些产品进行严格的毒理学评估。

**研究背景与目的**
调味空气吸入器（如Füm、Lio、Cigtrus）被宣传为安全、天然的吸烟和电子烟替代品，营销策略强调其“100%天然”成分和无尼古丁特性。然而，已有证据表明吸入精油可导致内分泌紊乱、神经毒性及不良心肺效应，且近期一例病例报告显示，一名健康女性因每日使用Füm吸入器而诱发急性嗜酸性粒细胞性肺炎。尽管这些产品直接向气道输送挥发性化合物，但尚无独立研究采用生理相关模型评估其对气道上皮细胞的影响。因此，研究人员开展本研究，旨在评估调味空气吸入器蒸汽对分化的人鼻气道上皮细胞的体外毒性，并假设暴露会导致不良呼吸道健康效应且效应因口味而异。该论文发表在《Archives of Toxicology》。

**研究结论与意义**
研究发现，仅一小时的调味空气暴露即可导致健康人鼻气道上皮细胞出现上皮屏障功能障碍、免疫失调和结构损伤，反驳了制造商的安全声明。研究结果强调，在缺乏充分安全性评估的情况下，这些产品不应被推荐用于吸入，亟需进行更严格的毒理学评价。

**主要关键技术方法**
研究从CONQUER队列研究（RGS0000004379）中招募8名20–30岁非哮喘成人（4名男性），通过鼻刷采集原代鼻气道上皮细胞，在气液界面（ALI）培养至少28天形成分化培养物。采用气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析六种调味空气设备芯体的化学成分。将ALI培养物暴露于医用空气（对照）或调味空气（1 L/min持续1小时）后，检测跨上皮电阻（TEER）、乳酸脱氢酶（LDH）释放（细胞毒性）、蛋白质浓度（BCA法）、27重细胞因子/趋化因子谱（Bio-Plex）及组织学（Alcian蓝/中性红染色）。采用线性混合效应模型进行统计分析，并通过冗余分析（RDA）和Spearman相关分析探索化学-生物学关联。

**研究结果**
**Chemical analyses（化学分析）**
GC–MS在六种产品芯体中检测到29种化合物，包括可能的致癌物pulegone（IARC 2B类，存在于4种芯体）和细胞毒性cinnamaldehyde（存在于2种芯体）。薄荷醇是主要成分（相对丰度15.6%–95.0%），所有产品均含石竹烯。14种化合物被归类为皮肤致敏剂（GHS H317），13种为皮肤/眼刺激物（GHS H315、H318或H319）。

**LDH and protein release（LDH与蛋白质释放）**
LDH释放方面，仅Cigtrus Icy Peppermint（CIP）的顶端LDH显著高于Cigtrus Grapefruit（CGF）（p=0.049），Lio Cinnamon Spice（LCS）的基底部LDH显著高于空气对照（p=0.020），其余处理与空气对照无显著差异。蛋白质浓度方面，CGF的顶端蛋白质显著高于空气对照（p=0.031），Füm Maple Pepper（FMP）的基底部蛋白质显著低于空气对照（p<0.001）。

**Permeability（通透性）**
TEER测量显示，除CGF外，其余五种调味空气处理均显著降低TEER（与空气对照相比，p<0.027），TEER降至空气对照的84.4%–91.8%，表明上皮屏障完整性受损。品牌嵌套模型证实所有三个品牌均显著降低TEER（Füm: -11.9%, Lio: -13.6%, Cigtrus: -9.7%; 均p≤0.002）。

**Mediators（介质）**
顶端介质释放呈现促炎性特征：LCS、Lio Minty Magic（LMM）和CGF诱导IP-10、GM-CSF、IL-7、RANTES和TNF-α升高，其中CGF引发最强烈的炎症反应；而Füm Crisp Mint（FCM）和CIP主要表现为免疫抑制，降低MIP-1α和IL-5等。基底介质释放普遍受到抑制，所有处理均降低IL-5、MIP-1α和VEGF，FMP和CIP抑制最显著。

**Histology（组织学）**
FMP和LCS处理导致单位基底膜长度蓝染阳性细胞（黏液细胞）数量显著减少（p<0.049），蓝染面积百分比降低。LCS上皮厚度显著大于FCM、FMP、CIP和LMM（p<0.022），FCM上皮厚度显著小于空气对照、CGF和LCS（p<0.008）。除LCS外，所有调味空气处理的纤毛评分均显著低于空气对照（p<0.042），表明纤毛覆盖率降低。

**Chemical–biological associations（化学-生物学关联）**
RDA解释43.8%的生物学变异（R²=0.438，调整R²=0.064），但未达到全局显著性（排列检验p=0.235）。Spearman相关分析发现41个显著化学-生物学关联。Pulegone与基底IL-17相关性最强（r_s=0.986, p<0.001）。薄荷萜类（menthone、menthyl acetate、isomenthone）簇与基底IL-5和IL-17升高及MCP-1抑制相关。Caryophyllene oxide与顶端IL-6、G-CSF、GM-CSF、TNF-α和MIP-1α呈负相关（r_s=?0.845, p=0.034）。Cinnamaldehyde与杯状细胞密度降低相关（r_s=?0.845, p=0.034）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，TEER的持续降低表明上皮屏障受损，这与慢性阻塞性肺疾病和哮喘等呼吸系统疾病的标志性特征一致。顶端促炎介质升高（如GM-CSF、IL-8、MCP-1、RANTES）提示直接毒性及腔面防御机制启动，而基底介质普遍抑制可能反映系统性免疫抑制，增加感染易感性。组织学变化（纤毛减少、黏液细胞减少、上皮厚度改变）进一步损害黏膜纤毛清除功能。化学分析中检测到的pulegone和cinnamaldehyde具有已知毒性，而薄荷醇可能掩盖刺激感并促进更深吸入。RDA分析显示产品聚类主要依赖品牌，但口味类别（薄荷vs香料）对生物效应的决定作用更强。

研究结论（翻译）：总之，含有精油的调味空气吸入器在仅一小时的暴露后即导致健康人鼻气道上皮细胞出现显著的上皮屏障功能障碍、炎症失调和结构损伤。研究人员的发现反驳了制造商的安全声明，并引发了对这些产品在缺乏充分安全性评估的情况下进行营销的适当性的担忧。在这些产品被推荐用于吸入之前，亟需进行更详细的毒理学评估。