《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：Effects of red clover (Trifolium pratense L.) on type 2 diabetes mellitus parameters: a systematic review
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背景：红三叶草（Trifolium pratense）及其异黄酮（formononetin, biochanin A）因其对葡萄糖代谢和相关代谢结果的潜在影响而被研究。方法：研究人员根据PRISMA指南，通过检索PubMed、Web of Science、Em
背景：红三叶草（Trifolium pratense）及其异黄酮（formononetin, biochanin A）因其对葡萄糖代谢和相关代谢结果的潜在影响而被研究。方法：研究人员根据PRISMA指南，通过检索PubMed、Web of Science、Embase、Scopus和Google scholar，对评估红三叶草提取物或分离异黄酮对血糖结局影响的研究进行了全面系统检索。纳入人类、动物和体外研究。结果：16项研究（18个数据集）符合纳入标准，包括3项人体研究、11项动物研究和4项体外研究。体外研究一致证实红三叶草对葡萄糖代谢具有有利影响，包括增强β细胞活力、减少凋亡、增加胰岛素分泌以及激活代谢通路（如PPAR-α）。动物研究普遍报告了血糖控制和胰岛素敏感性的改善，包括空腹血糖和HbA1c降低，以及代谢调节因子（如SIRT1）的调节。相比之下，人体试验的证据有限且不一致。仅有一项随机对照试验报告空腹胰岛素显著改善，而各研究间未观察到空腹血糖或HbA1c的一致效应。临床证据的解释受到试验数量少、样本量小以及研究人群、干预措施和结局指标异质性的限制。结论：临床前研究提示红三叶草可能发挥降血糖和胰岛素增敏作用；然而，这些发现在人体研究中尚未得到一致证实。需要使用标准化红三叶草制剂的高质量、充分把握度的随机对照试验来确定其在代谢疾病管理中的疗效和安全性。
1 引言
尽管由于高血压、血脂异常和糖尿病药物治疗的进步，以及生活方式干预、早期检测和预防性医疗策略的改善，高收入国家心血管疾病（CVD）的死亡风险有所下降，但目前超过四分之三的CVD相关死亡发生在低收入和中等收入国家（LMICs），CVD仍是这些国家的主要死亡原因。空腹血糖受损（IFG）和2型糖尿病（T2DM）是CVD和代谢综合征（MetS）发生的主要危险因素。急性低血糖已被证明与CVD死亡率高风险相关。在LMICs，T2DM等慢性疾病的常规药物成本高昂且获取受限，这促使人们转向草药等替代疗法。根据ACCISS研究，T2DM在LMICs可能是一种昂贵的疾病。在许多发展中地区，传统和补充医学是高达80%人口的首选医疗方式之一，主要因其文化熟悉性、可负担性和当地自然疗法的可获得性。多项系统综述和荟萃分析已检验了各种药用植物（如胡芦巴、大蒜、黑种草、肉桂、石榴和莳萝）对血脂和空腹血糖的影响。然而，关于红三叶草（RC, Trifolium pratense）效应的汇总数据仍然稀缺。因此，本系统综述旨在批判性评估和综合红三叶草对血糖标志物（包括空腹血浆葡萄糖（FPG）/空腹血糖（FBS）、胰岛素水平和HbA1c）的临床前和临床证据，提供对其治疗潜力的全面理解，并确定未来研究方向。
2 方法学
本系统综述和荟萃分析按照PRISMA 2020指南设计、实施和报告。每一步由两名独立审稿人执行，审稿人之间的任何分歧通过讨论或由第三名审稿人裁决解决。本研究方案未在任何组织注册。由于纳入研究之间存在显著的临床和方法学异质性，未进行定量荟萃分析。
2.1 检索策略
在Web of Science、PubMed、Scopus、Embase和Google Scholar中进行全面检索，检索时间截至2026年4月，无日期限制，仅限英文发表文章。检索策略将术语“Trifolium pratense”或“red clover”与血糖控制相关关键词（包括“blood glucose”、“fasting blood glucose”、“hemoglobin A1C”、“insulin resistance”、“insulin sensitivity”和“HOMA-IR”）结合。符合条件的研究包括评估RC或其提取物对血糖控制生物标志物影响的原创研究文章（人类、动物）。详细检索策略见补充表1。
2.2 纳入标准
纳入评估Trifolium pratense（红三叶草）或其成分（如formononetin、biochanin A、分离异黄酮、标准化提取物或其他红三叶草衍生制剂）对血糖标志物（包括FBS、FBG、胰岛素抵抗（IR）、血红蛋白A1c（HbA1c））影响的英文原创实验研究，包括随机对照试验（RCTs）、对照临床试验、动物研究和体外研究。排除无完整数据的综述、社论、评论、信件或会议摘要。
2.3 研究筛选
通过数据库检索识别的所有记录导入EndNote参考文献管理软件，第一步去除重复。随后，两名审稿人独立筛选标题和摘要，根据预先定义的纳入标准排除不相关研究。
2.4 数据提取
两名审稿人使用标准化表格独立进行数据提取。对于每项纳入研究，收集作者、发表年份、研究设计、模型（体外、动物或人类）、样本特征、干预类型（红三叶草提取物或分离异黄酮）、剂量、治疗持续时间、评估结局和主要发现。
2.5 偏倚风险评估
使用Cochrane偏倚风险工具（RoB 2.0）评估人体RCTs。使用SYRCLE偏倚风险工具评估动物研究。偏倚风险评估结果以表格和叙述形式总结。被判定为高偏倚风险的研究纳入分析，但进行敏感性分析以评估其对总体结果的影响。
2.6 证据分级（GRADE）
使用GRADE（推荐评估、发展和评价分级）评估每个结局的证据确定性。每个结局的总体证据确定性分类为高、中、低或极低。
2.7 伦理考虑
所有结果和分析来自既往已发表研究；因此，无需伦理批准和患者同意。所有纳入研究均已获得伦理批准声明。
3 结果
图1展示了研究筛选过程。在最初识别的611条记录中，497条因重复在筛选前被排除。另有90篇文章因不符合条件被排除。在评估全文的15篇文章中，一篇因以西班牙语发表被排除。共14项研究符合纳入标准并纳入系统综述。由于两项研究报告了两种不同实验的结果，最终分析了16个数据集：3项为人体临床研究，11项为动物研究，4项为体外研究。
3.1 结果总结
3.1.1 细胞研究（n=3）
阳性：4/4（100%）——所有研究均报告有益机制效应（糖化抑制、PPAR-α激活、β细胞保护）。无效应：0/3（0%）。
3.1.2 动物研究（n=10）
阳性：10/11（90%）——大多数研究显示FBG、HbA1c、胰岛素、HOMA-IR、血脂或葡萄糖耐量改善。无效应：1/10（10%）——Qiu等人2012年（STZ糖尿病小鼠，RCE）报告无降血糖效应。
3.1.3 人体研究（n=3）
阳性：1/3（33%）——Masuda 2021（↓空腹胰岛素）。无效应：2/3（67%）——Blakesmith 2003、Howes 2003未发现显著血糖益处。
3.1.4 总体（n=16项研究，18个数据集）
阳性效应：15/18（≈83%）。无效应：3/18（≈17%）。
3.1.5 偏倚风险评估
表4显示偏倚风险评估结果。大多数动物研究被评估为存在一些偏倚风险；一项报告良好的动物试验（随机分组牛研究）评级较好（低-中度）。人体证据包括3项小型RCT，其中两项把握度不足（n=16-25）和/或持续时间短；报告缺陷（分配隐藏不明确、样本量论证有限）意味着人体试验总体存在一些偏倚风险至高度风险。
3.1.6 GRADE评估
由于GRADE是为人类临床结局开发的，通常不用于动物或体外研究，且考虑到本研究仅有3项人体RCT，所有评估的血糖结局的临床证据确定性为低或极低（补充表2）。
4 讨论
本综述中，来自14项原创研究（16组结果）评估红三叶草（Trifolium pratense L.）对血糖结局影响的发现被分为细胞研究、动物研究和人体研究。收集的数据表明，红三叶草衍生的提取物和异黄酮对血糖标志物（包括FBS、FBG、HbA1c、IR和代谢通路终点）具有积极影响。然而，尽管红三叶草在临床前模型中显示出对葡萄糖调节的有前景效应，但当前人体证据尚不足以得出临床结论，主要由于偏倚风险、样本量小和干预措施的异质性。体外研究提供了RC抗糖尿病特性潜在机制的重要数据。Hosseini等人表明，红三叶草水醇提取物对血红蛋白糖化无影响，而纯化异黄酮（如daidzein和genistein）显著抑制糖化。血红蛋白糖化是一种非酶促、不可逆的化学反应，其中单糖（如葡萄糖）与血红蛋白结合，主要发生在β链氨基末端，形成不稳定的Schiff碱，随后重排为稳定的酮胺。平均血糖水平越高，血红蛋白糖化程度越高。这种糖化将血红蛋白转化为HbA1c，由于该过程的不可逆性，血红蛋白在整个红细胞寿命（约90-120天）内保持此状态。因此，HbA1c指示过去3-4个月的平均血糖水平，是长期血糖控制的有用指标。这与血糖测量形成对比，后者提供采血时血糖浓度的快照，并受激素、疾病、食物摄入和体育锻炼等变量的高度影响。HbA1c被认为是糖尿病及其并发症的可靠诊断/监测生物标志物。Park等人表明，biochanin A增强HEK293细胞（源自人胚胎肾脏）中过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）转录活性，与Wy-14643（一种PPAR-α激动剂）联合使用时具有协同效应，支持其在脂质和葡萄糖代谢调节中的作用。PPAR-α主要通过调节参与脂肪酸转运/氧化的基因表达来维持脂质稳态。Wy14643增加脂肪组织和肌肉组织的胰岛素敏感性（可能由于改善脂肪酸β-氧化和减少组织脂质含量）并改善葡萄糖稳态。此外，它们还可能通过影响胰腺功能来影响葡萄糖稳态。在另一项工作中，其他研究人员报告，红三叶草水醇提取物保护胰腺β细胞免受链脲佐菌素诱导的细胞毒性，改善活力，减少凋亡，并在低糖和高糖条件下增加胰岛素分泌。总体而言，这些体外研究表明红三叶草异黄酮可能影响糖化过程、核受体通路和β细胞保护。动物研究提供了RC降血糖效应最一致的证据。在一项糖尿病小鼠模型的实验研究中，RC提取物以剂量和时间依赖性方式显著降低FBG；而在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病C57BL/6小鼠中，相同提取物未能降低血糖，尽管biochanin A和formononetin也未显示直接降血糖效应。Park等人报告，膳食biochanin A补充剂降低高脂饮食（HFD）喂养肥胖小鼠的FBG、胰岛素和HOMA-IR，与改善胰岛素敏感性一致。Yokoyama等人表明，红三叶草芽粉降低西方饮食喂养肥胖小鼠的空腹血糖，在药理学测试中，单次剂量formononetin降低餐后血糖波动而不影响胰岛素。在糖尿病大鼠模型中，Oza和Kulkarni报告formononetin降低血糖、HbA1c和HOMA-IR，同时改善胰岛素和葡萄糖耐量。他们随后的研究证实，红三叶草花序水提物降低FBG、胰岛素、HbA1c和HOMA-IR，同时增强胰岛素敏感性。在糖尿病心肌病模型中，同一研究人员表明biochanin A显著降低血糖并改善心脏氧化应激标志物。Melchior等人报告红三叶草异黄酮在肉牛中具有降血糖效应，但胰岛素水平无变化。最近，Khazaei等人证明红三叶草来源的类外泌体纳米颗粒降低STZ糖尿病大鼠的FBG并增加胰岛素，同时调节与β细胞功能和胰岛素合成相关的胰腺基因。总体而言，这些动物研究强调了红三叶草异黄酮和提取物的一致血糖益处，但根据物种、糖尿病模型和提取物组成存在差异。人体临床研究结果异质性显著。Blakesmith等人报告在健康绝经前女性中补充红三叶草异黄酮后，空腹血糖、胰岛素或HOMA-IR无显著变化。Howes等人同样观察到在患有T2DM的绝经后女性中HbA1c无显著变化。相比之下，Masuda等人发现八周冻干红三叶草芽提取物降低年轻成年人的空腹胰岛素和HbA1c，并在口服麦芽糖耐量试验后减弱餐后血糖波动。这些发现表明临床益处可能依赖于背景，受年龄、基线血糖状态和提取物成分影响。总体而言，纳入研究的证据表明，主要的RC异黄酮（特别是biochanin A和formononetin）发挥与葡萄糖调节相关的生物学效应。提出的机制包括抑制蛋白质糖化、激活PPAR介导的通路、保护胰腺β细胞和改善胰岛素敏感性。动物模型的发现一致支持降血糖活性，而人体试验数据更有限且结果不一，在特定亚组中观察到潜在益处。这种变异性可能反映了提取物标准化、异黄酮组成、剂量、研究持续时间和研究人群的差异。该领域的进展取决于进一步使用标准化干预措施的严格对照临床研究，以确认其在血糖管理中的临床意义。
5 结论
临床前研究的证据表明，红三叶草（Trifolium pratense L.）及其异黄酮可能通过改善血糖控制、胰岛素敏感性和β细胞功能来改善葡萄糖稳态。然而，人体研究的证据仍然有限、异质且不确定，仅报告空腹胰岛素有适度改善，而空腹血糖或HbA1c无一致效应。尽管临床前发现支持红三叶草作为代谢调节剂的潜力，但当前临床证据不足以确定其在胰岛素抵抗或2型糖尿病管理中的疗效。需要设计良好、充分把握度的随机对照试验，使用标准化红三叶草制剂，以阐明其治疗作用。
6 局限性
本综述存在若干局限性。首先，大部分可用证据来自体外和体内（动物）研究，这些研究虽对机制见解有价值，但可能无法直接转化为人类生理。其次，仅有两项人体临床试验具有足够可提取数据，因此未进行荟萃分析。第三，研究设计存在异质性，包括不同的红三叶草制剂（全提取物、标准化提取物、分离异黄酮或外泌体）、不同剂量和可变治疗持续时间，这使直接比较复杂化。
