《Cancer and Metastasis Reviews》：Lung tumour secretome and extracellular vesicles: mechanisms, biomarkers, and therapeutic opportunities
肺癌进展不仅受肿瘤内在遗传改变控制，还受肿瘤细胞与周围微环境之间的动态通讯影响。这种通讯的重要组成部分是肿瘤分泌组（tumour secretome），包括可溶性因子和细胞外囊泡（EVs），它们有助于调节肿瘤生长、侵袭、免疫逃逸和治疗抵抗。通过这些机制，分泌组组分和EVs促进表型可塑性、微环境重塑以及对缺氧、免疫监视和治疗应激的适应性反应。重要的是，分泌组衍生因子和EVs释放到可获取的生物体液中，包括血液、支气管肺泡灌洗液和胸腔积液，突出了它们作为微创生物标志物的潜力。在这篇综述中，研究人员检查了肺癌分泌组，包括可溶性分泌因子和EVs，重点强调它们对肿瘤进展、转移、免疫调节以及对靶向治疗、免疫治疗和放疗的抵抗的贡献。研究人员讨论了EV分离、表征和分子谱分析方面的方法学进展和持续存在的技术挑战，这些影响重现性和解释。研究人员进一步评估了新兴的临床应用，包括液体活检（liquid biopsy）、治疗监测和治疗靶向，并考虑它们在精准肿瘤学框架内的整合。最后，研究人员强调了临床转化的关键障碍，并概述了未来研究的优先事项，包括方法学标准化、前瞻性临床验证以及开发选择性靶向肿瘤衍生分泌信号的策略。
1 Introduction
1.1 Lung cancer: clinical burden and unmet needs
肺癌是全球最常见且死亡率最高的癌症之一，每年约220-250万新发病例和180万死亡病例。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80-85%，小细胞肺癌（SCLC）占10-15%。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂改善了部分患者预后，但总体生存率仍低，尤其转移性病例。当前临床管理依赖影像和组织活检，但存在假阳性率高、取样偏差、难以捕捉肿瘤时空异质性等局限，因而需要微创生物标志物以实现动态纵向评估。肺癌中分泌组和EV研究具有特别意义，因为NSCLC和SCLC表现出高度异质性、频繁转移和治疗适应，且肺持续暴露于吸烟相关损伤和环境因素，使分泌信号和EV组成发生重塑。分泌因子和EV可在血液及肺邻近生物体液（如痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液）中评估，为纵向分析提供机会。
1.2 Intercellular communication, tumour secretome, and EVs
肿瘤分泌组（tumour secretome）包含肿瘤细胞及相关基质和免疫细胞释放的可溶性因子和EVs，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白酶、脂质和代谢物，它们通过促进增殖、血管生成、免疫逃逸、侵袭、转移和治疗抵抗来塑造肿瘤微环境。EVs是膜结合颗粒，根据大小和生物合成分为小EVs（sEVs）、大EVs（lEVs）和凋亡小体，但由于技术限制，许多研究采用操作分类如“EVs”。EVs转运蛋白质、脂质、代谢物和核酸，实现局部和远处细胞间信息传递。可溶性分泌组分和EVs均释放到可获取生物体液中，使其成为微创液体活检（liquid biopsy）的候选工具。积累证据表明，分泌组和EV介导的信号在肺癌（尤其NSCLC）进展中发挥重要作用，包括免疫逃逸、基质重编程、转移前微环境形成和治疗抵抗，例如肿瘤衍生EVs促进预转移微环境形成，EV相关PD-L1抑制T细胞活性，EV介导的致癌物转移激活生存信号通路。
2 Biological functions of the lung cancer secretome: soluble factors and EVs
2.1 Secretome and EV signalling in tumour growth, survival, and stemness
肿瘤生长和生存可通过分泌组和EV信号得到支持，这些信号增强致癌通路并适应微环境应激。可溶性因子如IL-6、IL-8、VEGF通过自分泌/旁分泌环维持STAT3和ERK驱动的生存信号。EV相关蛋白如磷酸化EGFR激活下游AKT和ERK信号；EV富集的microRNA如miR-21、miR-155通过抑制PTEN、PDCD4促进细胞存活。EV脂质如鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸影响膜流动性并激活促生存信号。在EGFR突变NSCLC中，肿瘤衍生EVs携带磷酸化EGFR和miR-21、miR-155，增强AKT/ERK激活并抑制PTEN。分泌组和EVs也参与肿瘤干细胞（CSC）维持，通过激活Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3、TGF-β/SMAD、PI3K-AKT-mTOR等通路促进自我更新、可塑性和治疗抵抗。EV介导的干性调控物转移使非干性肿瘤细胞获得干性表型，例如CSC衍生EVs中的lncRNA ROLLCSC通过调节miR-5623-3p/miR-217-5p促进干性和转移特性。在SCLC中，成纤维细胞衍生分泌组和EVs可驱动表型重编程和化疗耐药。
2.2 Secretome- and EV-mediated invasion, EMT, and metastasis
肺癌分泌蛋白酶和细胞外基质修饰酶降解物理屏障，可溶性细胞因子和生长因子促进上皮-间充质转化（EMT），增强侵袭性。在NSCLC中，EMT常为部分可逆过程，TGF-β、IL-6、MMP-9通过Smad和STAT3信号驱动部分EMT，同时保留上皮特征。EVs通过转移促迁移和EMT相关物（如整合素α6β4、miR-155）放大侵袭程序，调节细胞-基质相互作用和细胞骨架重组。EV相关脂质也通过调节膜流动性和迁移能力促进侵袭。肿瘤衍生EVs可在循环肿瘤细胞到达前预处理远处组织，分泌因子如TGF-β、IL-6、VEGF及EV携带的整合素α6β4、miR-21、PD-L1改变血管通透性、基质组成、炎症信号和免疫监视，促进预转移微环境形成。例如，缺氧肺癌细胞来源sEVs富集miR-23a增强血管生成和通透性；NSCLC来源sEVs携带miR-3157-3p调节TIMP/KLF2信号促进血管生成和转移；休眠肺腺癌细胞来源sEV ITGB6通过KLF10/TGF-β机制激活成纤维细胞和细胞外基质重塑。
2.3 Regulation of angiogenesis and stromal remodelling by secretome and EV signalling
肺癌分泌促血管生成因子如VEGF、PDGF、FGF及细胞外基质修饰酶（如MMPs、LOX）激活内皮细胞、促进新血管形成并重塑基质结构，形成的血管通常紊乱且高通透性。EVs通过转移生物活性物至内皮细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）参与血管和基质调节，EV相关蛋白刺激内皮增殖和迁移，EV富集miRNA调节VEGF/HIF-1α和成纤维细胞激活信号，EV相关脂质通过破坏连接稳定性和激活RhoA、NF-κB信号影响内皮屏障功能。基质重塑改变细胞外基质组成、刚度和组织，在NSCLC中形成致密胶原屏障限制药物递送和免疫细胞浸润，增加基质刚度促进T细胞功能障碍。在SCLC中，类似基质支持机制可能也存在，但直接EV证据有限。
2.4 Immune modulation and immune evasion driven by secretome and EVs
肺癌分泌免疫调节细胞因子（TGF-β、IL-10、IL-6）和趋化因子（CCL2、CXCL12）抑制抗肿瘤免疫，损害抗原呈递，促进免疫抑制细胞群募集。EVs通过递送保护性生物活性物直接调节免疫细胞，EV相关蛋白如PD-L1、FasL抑制细胞毒性淋巴细胞活性，诱导活化T细胞凋亡；EV富集miRNA通过靶向IRAK1、TRAF6等TLR信号成分减弱NF-κB激活。肿瘤衍生EVs还调节巨噬细胞极化向M2/肿瘤支持表型，并通过脂质影响膜组织和先天免疫受体信号。自然杀伤（NK）细胞和树突状细胞也受EV调节，肿瘤衍生EVs可能通过下调NKG2D受体损害NK细胞监视，但PD-L1缺失的A549来源sEVs减少对NK细胞活性的抑制。肿瘤衍生EVs也可抑制树突状细胞分化和成熟，降低CD11c、CD80、CD86、MHC II类表达，并增加PD-L1表达促进调节性T细胞分化。然而，树突状细胞来源EVs可携带肽-MHC复合物和共刺激分子激活NK细胞，早期临床研究显示抗原负载树突状细胞来源EVs在晚期NSCLC中可行且耐受，II期研究增强NKp30依赖性NK细胞功能。EV介导的免疫调节不仅限于局部微环境，还可通过循环在远处发挥免疫抑制效应。
2.5 Secretome- and EV-mediated therapy resistance and radiation response
治疗抵抗中，分泌组和EV介导的适应性信号发挥重要作用。化疗、靶向治疗、免疫治疗或放疗后，肿瘤细胞动态改变分泌谱，上调IGF1、HGF、TGF-β、IL-6、VEGF等因子，产生补偿性生存信号。治疗诱导的分泌程序通过激活RTK旁路信号（如IGF1R-PI3K-AKT）、STAT3依赖炎症通路和TGF-β/SMAD信号促进适应性抵抗。EVs传播抵抗特性，EV相关蛋白如EGFR、MET、survivin及DNA修复调节因子（ATM、DNA-PKcs、RAD51）在受体细胞中增强生存信号和DNA损伤反应，EV富集miRNA抑制凋亡、调节细胞周期和促进药物耐受状态。辐射后释放的可溶性因子（IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β、IGF-1、HMGB1）激活STAT3、NF-κB、PI3K-AKT信号，促进辐射抵抗和旁效应；辐射后EVs传递增强DNA修复能力、减少细胞死亡并促进存活的肿瘤细胞再增殖。在SCLC中，快速发展的放化疗抵抗是临床特征，分泌组和EV驱动的适应性信号可能参与其中。
3 Technical and methodological challenges in secretome and EV research
3.1 Experimental and clinical approaches for secretome collection
分泌组研究的准确依赖于标准化的收集、处理和归一化。体外模型包括二维培养、三维球体、类器官或共培养系统，但二维培养缺乏微环境特征，三维和共培养更接近病理条件但引入额外变异。所有体外平台需严格控制血清条件，使用无血清培养基或EV耗竭胎牛血清，并密切监测培养时长、细胞密度和活力。患者来源生物体液（血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液）是最临床相关的来源，但存在高丰度蛋白干扰、稀释效应和炎症背景等问题。预分析变量（收集方案、处理时间、离心程序、温度控制、储存条件）是主要变异来源，需采用协调程序。遵循MISEV2023指南，使用验证的EV分离方法、多模式表征和一致归一化策略可提高可靠性。ISEV开发了MIBlood-EV框架和MIFlowCyt-EV框架用于报告血液和流式细胞术相关变量，这些框架促进透明文档和跨研究比较。
3.2 Isolation and characterisation of EVs in lung cancer
EV分离是技术挑战，与可溶性因子和非囊泡纳米颗粒共存，需权衡纯度、产量、可扩展性和选择偏差。差速超速离心（differential ultracentrifugation）广泛使用但共分离污染物、损害囊泡完整性、耗时。尺寸排阻色谱（SEC）更有效分离EVs与可溶性蛋白并保持结构，但倾向富集小EVs而低估大EVs。超滤和切向流过滤用于浓缩，但可能引入剪切应力或选择性富集。密度梯度离心提供更高纯度但技术复杂。亲和捕获使用抗EpCAM抗体富集肿瘤相关EVs，但引入标记依赖性选择偏差，EpCAM在NSCLC中因EMT和转移而下调，导致丢失侵袭性表型。EV表征需根据MISEV2023指南，使用多种互补方法确认囊泡身份，包括检测四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）和胞质EV标志物（TSG101、ALIX），排除非囊泡污染物（载脂蛋白、钙联蛋白等），测量粒径和浓度，可视化形态。由于将囊泡归因于特定生物合成途径仍有困难，许多研究采用操作术语如“sEVs”，并需透明报告分离方案、表征标准和方法学限制。
3.3 Molecular profiling and functional analysis of secretome and EV cargo
下游分析平台包括蛋白质组学、RNA谱分析、代谢组学和脂质组学。质谱蛋白质组学可鉴定致癌信号、EMT重塑、血管生成和免疫调节相关蛋白，但血浆中高丰度蛋白限制检测低丰度肿瘤蛋白，需采用高丰度蛋白耗竭、EV富集和多重定量策略。靶向蛋白质组学和抗体多重平台更适用于假设驱动验证。RNA谱分析中EV相关microRNA和非编码RNA被广泛研究作为早期检测、预后分层和治疗监测的微创标志物，但区分囊泡相关RNA与非囊泡载体是一大挑战，需使用合成外参和标准化归一化。代谢组学和脂质组学提供代谢重编程和生物活性信号补充信息，但对样品处理高度敏感。功能分析需结合全条件培养基、EV耗竭组分和纯化EV在体外或体内模型中比较，以证明EV依赖性效应。EV摄取并非均匀，需控制剂量和实验条件。整合分子谱分析与功能验证，并在患者来源样本中验证，可增强因果推断和转化相关性。
4 Clinical and translational applications of secretome and EV profiling
4.1 Secretome and EV biomarkers for lung cancer detection and screening
分泌组和EV生物标志物因在微创生物体液中的可及性和反映动态肿瘤-微环境相互作用而成为有前景的候选。脂质双层保护EV相关蛋白和核酸免于降解，选择性装载可富集肿瘤信号。血浆和血清中EV相关蛋白和非编码RNA已被研究用于区分肺癌与良性肺部疾病，并补充影像筛查。一些研究在回顾性队列中报告中等至高诊断准确性，但性能在吸烟者或炎症性肺病患者中可能下降，且大多数候选标志物缺乏前瞻性多中心验证。目前证据表明EV衍生标志物更可能作为辅助工具细化风险分层和影像判读，而非独立筛查手段。支气管肺泡灌洗液和痰液等气道邻近生物体液可能提供更高肿瘤特异性，但需要侵入性支气管镜取样，并受稀释和炎症背景影响。肿瘤衍生EVs仅占循环囊泡一小部分，尤其早期，信噪比低。多分析物组合（结合EV特征、临床变量和影像）可能优于单一标志物。生物学混杂因素（吸烟损伤、慢性炎症、COPD）可改变分泌组组成，需在验证中纳入相关对照人群。因此，分泌组和EV生物标志物最现实的近期角色是作为影像、组织标志物和ctDNA的补充工具，用于细化不确定肺结节风险分层、监测治疗反应和检测早期耐药。
4.2 Predictive and pharmacodynamic applications of secretome and EV biomarkers
分泌组和EV生物标志物作为预测和药效学工具可指导治疗选择和监测反应。在NSCLC中，靶向治疗和免疫检查点抑制剂常受原发性或获得性耐药限制，微创获取循环分泌组分和EVs可实现重复采样，动态反映肿瘤生物学和治疗反应。EV相关蛋白和非编码RNA可反映通路激活状态、免疫背景和肿瘤-微环境相互作用，可能比单点活检更好地捕捉肿瘤异质性和耐药机制。药效学应用通过纵向采样评估治疗诱导的分泌组变化，EV相关信号分子改变可能在影像进展前提示生物反应或耐药。与ctDNA相比，ctDNA提供肿瘤遗传改变的高度特异性检测，但敏感性在早期或低DNA脱落肿瘤中受限，且不直接反映蛋白质信号和免疫相互作用；分泌组和EV标志物可提供互补功能信息。但临床转化仍受分离方法变异、分析平台不一致和缺乏前瞻性验证限制。已有多个注册临床试验在探索EV生物标志物，包括早期检测、分子分型、治疗反应预测，但大多数仍处于观察性或探索性阶段，需更大规模前瞻性多中心研究。
4.3 Therapeutic targeting and engineering of secretome and EVs
破坏分泌组和EV介导的通讯网络是潜在治疗策略，旨在削弱肿瘤微环境支持系统。一种策略是靶向促肿瘤细胞因子、趋化因子和生长因子，通过抑制旁分泌信号和基质激活来减轻微环境支持并增强现有疗法疗效。另一种策略是抑制EV生物发生和释放，如Rab27a沉默和中性鞘磷脂酶抑制，已在体内减少sEV分泌并抑制肿瘤生长和转移，但非特异性抑制可能引起全身毒性，需选择性靶向肿瘤衍生EVs或肿瘤特异性EV货物。此外，利用工程化EVs作为治疗递送载体，已证明可递送功能性siRNA并抑制肿瘤模型中致癌信号，但面临可扩展制造、可控货物装载和分布等障碍。分泌组和EV靶向策略也可增强联合治疗，通过破坏肿瘤-微环境通讯来延迟或克服耐药。总体而言，治疗靶向仍处于早期阶段，需识别肿瘤特异性分泌脆弱性、开发选择性干预策略并克服技术挑战。
5 Challenges and strategic priorities for clinical translation of lung cancer secretome and EVs
5.1 Defining tumour-specific secretory signalling and functional relevance
关键挑战包括可靠区分肿瘤衍生分泌组分和EVs与非恶性细胞释放的组分。肺中分泌谱反映上皮、基质、免疫和内皮细胞的贡献，吸烟损伤、慢性炎症等进一步复杂化。许多报告的信号可能代表复合微环境反应而非肿瘤特异性信号。EV货物装载的分子决定因素尚不完全清楚，涉及ESCRT依赖分选、四跨膜蛋白介导选择和RNA结合蛋白装载。当前多数证据来自体外或离体系统，需严格体内验证（如谱系追踪、遗传扰动）以确定真实功能层次。此外，分泌组和EV信号的时间动态尚未完全表征。优先研究方向包括：解决细胞起源和背景依赖性，确定特定分泌因子或EV货物与临床相关过程（转移器官趋向性、免疫逃逸、治疗抵抗）的因果关系，以及通过纵向研究表征疾病进展和治疗中的时间重编程。
5.2 Translational and clinical implementation barriers
临床转化主要障碍是缺乏明确临床使用场景，需证明分泌组和EV检测相对于现有诊断和监测手段（影像、组织活检、ctDNA）的附加价值。未来应优先解决未满足需求，如细化不确定影像、检测早期治疗抵抗、提供肿瘤-微环境相互作用的功能性洞察。另一个主要限制是缺乏大规模前瞻性多中心临床验证，大多数候选标志物来自小规模回顾性研究。需设计严格的前瞻性试验，明确终点、标准化方案和多样化队列。整合到临床工作流程还需定义最佳采样间隔、临床有意义阈值及如何指导治疗决策。治疗应用方面，选择性靶向肿瘤衍生分泌信号而不干扰生理过程是挑战，EV生物发生和分泌是基本细胞功能，非特异性抑制有全身毒性风险；EV治疗递送系统面临可扩展制造、货物装载效率、生物分布和调控批准等挑战。
5.3 Emerging opportunities and strategic research priorities
当前局限需通过技术创新、机制研究和临床研究协调推进。关键优先事项是识别肿瘤特异性分泌组和EV标志物，实现选择性检测或靶向。高分辨率和单囊泡分析技术（single-vesicle analysis）有望解决循环EV群体的异质性，识别潜在肿瘤衍生EV亚群和稀有但重要的囊泡群体，但受技术复杂性、成本、通量和标准化限制。单囊泡分析应视为补充策略，需进一步技术发展和前瞻性验证。整合分泌组和EV谱分析与互补分子和空间技术（基因组、转录组、蛋白质组、空间谱分析）可全面映射肿瘤通讯网络。纵向研究嵌入前瞻性临床试验，将分泌组和EV动态与治疗反应和患者结局直接关联。治疗方面，优先发展选择性靶向肿瘤特异性分泌通路或EV货物，而非全局抑制囊泡生物发生。最终，分泌组和EV研究最可能通过整合多模态精准肿瘤学框架产生最大影响，提供肿瘤-微环境通讯和适应性耐药的功能性洞察，补充基因组和影像策略。
6 Conclusions
分泌组和EV研究为肺癌（尤其NSCLC）的非细胞自主机制提供了重要见解，但方法和生物学挑战（样品处理变异、EV分离和分析平台差异、肺的复杂炎症和环境背景）限制重现性和解释。从转化角度，分泌组和EV方法有希望补充现有影像和组织诊断，通过微创纵向评估肿瘤-微环境相互作用，潜在应用包括早期检测、治疗监测和耐药识别。但临床实施需在明确临床场景中证明附加价值，并通过前瞻性验证支持。未来需继续整合机制洞察、稳健方法框架和临床驱动研究设计，以实现转化潜力。
