深度免疫表型分析揭示强直性脊柱炎中双阴性T细胞与PD-1介导的炎症耗竭

《Phenomics》：Deep Immunophenotyping Unravels the Double Negative T cells and PD-1-Mediated Inflammatory Exhaustion in Ankylosing Spondylitis

　　

强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis, AS）是一种主要累及中轴骨骼的慢性免疫介导的炎症性疾病，以脊柱骨融合和韧带骨赘形成为特征，导致活动能力受损、生活质量下降及死亡率增加。然而AS潜在的免疫失调机制仍知之甚少。研究人员对30例活动性AS患者（均为肿瘤坏死因子-α（TNF-α）阻滞剂初治）及30例年龄与性别匹配的健康对照者进行外周免疫全景分析，在未经生物制剂干扰的活动期捕获免疫特征。借助先进11色流式细胞术与FlowSOM聚类，分析了584种免疫表型，重点兼顾细胞组成与功能特征。AS患者呈现独特的“活化-耗竭”功能性免疫表型，以CD4+CD28+CD38+PD-1+ T细胞与HLA-DR+CD38+CD4?CD8?双阴性（Double-negative, DN）T细胞为主。DN T细胞在HLA-B27阳性患者中显著富集，提示其作为生物标志物的潜力。网络分析揭示与活动性疾病相关的7个中枢免疫亚群，而功能评估显示CD95+CD8+ T细胞凋亡受损及B细胞成熟紊乱。这些发现提供了生物制剂初治活动性AS的详细功能性免疫图谱，为精准干预提供新机制见解与候选生物标志物。

研究背景与立项依据

强直性脊柱炎（AS）是一种慢性免疫驱动的中轴型脊柱关节炎（Spondyloarthritis, SpA），与HLA-B27强相关，其病因涉及免疫、遗传与环境多因素。既往研究虽提示T细胞、B细胞、γδ T细胞、自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞等参与发病，且IL-23/IL-17轴被证实关键，但关于调节性T细胞（Treg）、滤泡辅助T（Tfh）细胞、PD-1等功能性标志的结论不一致；已有质谱流式（CyTOF）研究多聚焦生物制剂治疗人群，功能分辨率受面板限制。学界对AS未经生物制剂干扰的活动期外周免疫全景仍缺乏系统认识。为此，研究人员在《Phenomics》发表本研究，纳入TNF-α阻滞剂初治活动性AS患者，用多面板11色流式与无监督聚类绘制精细功能免疫图谱，旨在明确核心致病亚群与诊断标志物。

主要技术方法

研究人员在江苏泰兴医院风湿免疫科纳入30例符合1984年ACR标准、ASDAS>1.3的TNF-α阻滞剂初治AS患者及30例年龄性别匹配健康对照（Healthy Controls, HCs）。采用6个优化11色流式面板覆盖中性粒细胞（PMN）、单核细胞、树突状细胞（DC）、NK、NKT、黏膜相关不变T（MAIT）、γδ T、T效应/记忆、Treg、Th/Tc/Tfh、B细胞等；染色后于CytoFLEX LX采集，FlowJo分析比例与中位荧光强度（MFI）。高维数据经Cytobank行viSNE降维与FlowSOM聚类（每面板100簇归10元簇）；组间差异用Wilcoxon检验与Benjamini-Hochberg校正；细胞间关联用Spearman相关与igraph网络；诊断模型用LASSO回归选特征、随机森林（Random Forest, RF）算AUC与基尼重要性。

研究结果

活动性AS患者呈现广泛免疫细胞群改变

584个表型中146个改变（p.adj<0.1），65个显著（p.adj<0.05）。AS富集趋化因子受体定义的CD4⁺亚群及Tfh（含CCR6^?CCR4⁺CD4⁺、CXCR3^?CCR4^?Tfh、Th2），创始B细胞（Founder B）升高最著（Log₂FC=1.435）；DC、NK、γδ T及PD-1⁺CD4^?CD8^?T、CD57⁺衰老T、CD85j⁺抑制T降低。六大淋巴细胞中αβ T（尤CD4⁺）增、γδ T减。

AS中由HLA-DR⁺CD38⁺CD4^?CD8^?双阴性与CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺ T细胞介导的持久T细胞活化与耗竭

传统门控与viSNE/FlowSOM均显示：CD4⁺频率升（p=0.008）；DN T中HLA-DR⁺CD38⁺亚群富集（p=0.036）；CD57⁺在CD4⁺/CD8⁺/DP T中普遍下降（提示衰老减少、反应性强）。FlowSOM簇1（CD8⁺样效应）、簇3（CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺）增多，簇8（CD57⁺CD8⁺样）减少。结论：AS CD3⁺T响应以DN T活化、CD4⁺PD-1⁺耗竭、CD57⁺衰老T缺失为特征。

AS中中央记忆CD4⁺、CD8⁺及常规T细胞扩增伴CD95⁺CD8⁺ T细胞受损

CD45RA/CCR7/CD95分型示中央记忆CD4⁺（p=0.010）、CD8⁺（p=0.030）及常规CD4⁺（p=0.019）扩增；FlowSOM示CD95⁺CD127⁺CD8⁺（簇4）减少，提示凋亡清除障碍与慢性抗原暴露。

AS中Tfh与Th17细胞扩增伴Th17样Treg减少

基于趋化因子受体的分类显示Th2、Th17、Tconv、Tfh、Tfr均升，Th17样Treg与Tc17/Tc1降。viSNE/FlowSOM确认CCR4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh样富集、ICOS⁺CCR6⁺CD127⁺CD8⁺减少，提示Tfh-B轴活跃而抑制失衡。

AS中B细胞成熟偏移以创始B细胞扩增与记忆亚群减少为标志

创始B细胞显著升（p=0.012），非类别转换（IgD⁺CD27⁺）记忆B降（p=0.042）；FlowSOM示CD11c⁺CD24⁺CD27⁺IgM⁺B（簇8）富集、CD21⁺CD20⁺CD24⁺CD27⁺IgM⁺过渡B（簇4）减少，表明向活化/抗原经验表型偏移。

AS中γδ T细胞减少与细胞毒CD56⁺TCRVδ2⁺亚群扩增

αβ T增、γδ T（p=0.012）、Vδ2（p=0.024）、NKT、MAIT均减；FlowSOM示TCR-Vδ2⁺γδ T（簇3）降，CD56⁺NKG2D⁺TCRVα7.2⁺Vδ2⁺γδ T（簇1）升，向NK样细胞毒表型转变。

活化型MoDC与pDC扩增反映固有免疫激活

嗜碱粒升；静息pDC与髓样DC（mDC）频降，但FlowSOM示CD16⁺CD11c⁺单核源DC（MoDC，簇3/6）与CD38⁺CD123⁺活化pDC（簇10）富集。

多临床特征相关评估

Spearman分析示CD3⁺CD8⁺与HLA-DR⁺CD38⁺DN T与HLA-B27阳性正相关；分层后仅DN T在HLA-B27⁺显著富集。ASDAS与CCR6⁺CCR4⁺Treg、CD16^?mDC正相关。非常高危组富Tc17Tc1、CD16^?mDC、NKT；高危组富特定Tfh、中央记忆T、MAIT。DMARD组CD4⁺低于初治组，NSAID对轮廓影响小。男性富IgD-only记忆B、Tfh9/17、mDC。

差异免疫细胞群间相关评估

52个显著差异表型建网，CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺T与DN T各连13个群体成双中枢；前者连ICOS⁺CCR4⁺辅助T、CXCR5⁺ICOS⁺Tfh、CD127⁺CCR4⁺记忆T、CD16⁺CD11c⁺mDC；后者连CD4⁺、Tconv、中央记忆T、αβ T、mDC；两中枢借CD4⁺/Tconv/mDC桥接。

随机森林诊断模型识别关键免疫特征

LASSO选7特征（Tfh、CD3⁺ICOS⁺CCR4⁺、CD3⁺CD127⁺CCR4⁺CD4⁺、CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺T、αβ T、HLA-DR⁺CD38⁺DN T、CD16⁺CD11c⁺），RF的AUC=0.83；前四大贡献为Tfh、ICOS⁺CCR4⁺、CD127⁺CCR4⁺CD4⁺、CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺T。

讨论浓缩

研究人员指出，HLA-DR⁺CD38⁺DN T在AS中首获明确活化证据，且为HLA-B27⁺组唯一显著富集亚群；其异常表达MHC-II提示可作非经典抗原提呈细胞（APC）并产IL-17/IFN-γ/TNF-α等，借IL-23/IL-17轴促炎与异位成骨。CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺T处“共刺激（CD28）-抑制（PD-1/SHP2）”平衡态，即受控活化-早期耗竭，仍连ICOS⁺CCR4⁺等助炎亚群。CD95⁺CD8⁺减少意味Fas介导凋亡受损，致活化细胞堆积与免疫碎片持续刺激，并可能减少成骨细胞凋亡促骨赘。Tfh升、Th17样Treg降、非类别转换记忆B减而创始B/CD11c⁺B（近年龄相关B细胞ABC）增，共同描绘B细胞向慢性炎症/天然样重编程。CCR6⁺CCR4⁺Treg与CD16^?mDC随ASDAS升高，提示Treg迁移表型失调与DC促Th17。DMARD较NSAID更调CD4/CD8平衡。男性特有B/Tfh/mDC富集或部分解释性别差异。

结论翻译

本研究对AS行广泛免疫分析，借手动门控与FlowSOM无监督聚类从584表型中定52个显著改变亚群，揭示以HLA-DR⁺CD38⁺CD4^?CD8^?DN T与CD4⁺CD28⁺CD38⁺PD-1⁺T为核心的七亚群中枢，刻画活动期TNF-α阻滞剂初治AS的慢性低度“活化-耗竭”炎症态。该网络区分患者与对照（AUC 0.83），DN T且与HLA-B27关联，具机制与分型价值，为诊断监测与精准干预提供候选标志物集。