8-甲氧基补骨脂素和紫外（365 nm）诱导的大肠杆菌中氧化应激基因soxS和katG及SOS应答基因recA和colD的表达

《Russian Journal of Genetics》：Expression of Oxidative Stress Genes soxS and katG and SOS Response Genes recA and colD in Escherichia coli, Induced by 8-Methoxypsoralen and Ultraviolet (365 nm)

　　

研究人员研究了经UVA（365 nm）活化的8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）对大肠杆菌生物传感器中氧化应激基因soxS和katG以及SOS应答基因recA和colD表达的影响。发光细菌Photorhabdus luminescens的luxCDABE操纵子作为这些基因在生物传感器中表达的报道基因。采用分段回归的统计方法分析剂量-反应关系的动态变化。研究确定，当用UVA照射时，8-MOP分别在pSoxS-lux和pKatG-lux生物传感器的细胞中诱导超氧阴离子（O₂^-）和过氧化物（H₂O₂）的形成。同时，生物传感器反应的动态差异显著，表明相应启动子的激活顺序。pRecA-lux和pColD-lux生物传感器在DNA损伤条件下被激活；然而，后者具有显著更高的灵敏度。与recA、soxS和katG启动子相比，colD(cda)启动子显示出更宽的灵敏度和明显的信号放大效应。

**论文解读：8-甲氧基补骨脂素联合UVA诱导大肠杆菌氧化应激与SOS应答的基因表达研究**

**研究背景与问题**

PUVA疗法（8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）联合长波紫外线（UVA）照射）是临床治疗银屑病、湿疹、白癜风及皮肤T细胞淋巴瘤的有效手段，其作用机制基于8-MOP的光化学修饰DNA，形成单加合物和二加合物（链间交联）。然而，该疗法伴随显著致癌风险，包括鳞状细胞癌、基底细胞癌及黑色素瘤发生率升高，国际癌症研究机构（IARC）已确认其对人及实验动物的致癌性及遗传毒性。既往研究揭示了8-MOP在细菌（如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌）和哺乳动物细胞（如人成纤维细胞、CHO细胞）中诱导突变（碱基置换、移码突变）的机制，并明确了SOS修复系统对加合物的处理角色。但关于8-MOP+UVA如何直接诱导细胞内活性氧（ROS）形成，以及氧化应激基因（soxS、katG）和SOS应答基因（recA、colD）的实时表达动态，尚缺乏系统研究。为此，本研究利用大肠杆菌全细胞发光生物传感器，旨在同时检测8-MOP+UVA引起的氧化胁迫（超氧阴离子、过氧化物）和DNA损伤效应，并比较不同启动子（soxS、katG、recA、colD）的响应灵敏度与动力学特征。

**研究内容与结论**

研究人员采用四种基于大肠杆菌K12菌株MG1655构建的lux生物传感器（pSoxS-lux、pKatG-lux、pRecA-lux、pColD-lux），这些菌株分别携带受soxS、katG、recA、colD(cda)启动子调控的luxCDABE报告基因。在8-MOP（5×10^-5 mol/L）存在下，以UVA（365 nm，功率6.53 J/s·m²）照射不同时间（0–12 min），测量发光强度，并采用分段回归（segmented regressions）分析剂量-反应关系的动力学。研究发现：所有生物传感器发光随照射时间增加而增强，但动力学模式显著不同。pSoxS-lux在4 min时发光即超对照约4倍，8 min后趋于平台（拐点7.35 min），表明超氧阴离子（O₂^-）快速生成后信号稳定；pKatG-lux发光呈近线性增长，12 min时仍持续上升（总增幅约6.6倍），反映过氧化物（H₂O₂）持续积累。pRecA-lux在6 min内快速上升（拐点5.39 min），但基础表达水平较高；pColD-lux信号在4 min后急剧升高，10 min时出现拐点，总增幅达对照的40倍，为所有生物传感器中最高。这表明colD(cda)启动子对DNA损伤（包括单加合物、二加合物及可能伴随的膜损伤）具有更宽的敏感性和信号放大效应。该研究首次直接通过soxS和katG表达证实8-MOP+UVA诱导大肠杆菌产生ROS，并揭示了不同启动子响应顺序：soxS（超氧阴离子）先于katG（过氧化物）激活，而colD对DNA损伤的响应灵敏度优于recA。论文发表在《Russian Journal of Genetics》。

**主要关键技术方法**

本研究使用四种大肠杆菌K12 MG1655 lux生物传感器（由G.B. Zavil’gelskii和I.V. Manukhov提供，来自GosNIIGenetika，莫斯科），这些菌株分别携带重组质粒，其上soxS、katG、recA或colD(cda)启动子位于luxCDABE操纵子上游，从而通过发光强度反映相应基因的表达水平。8-MOP（Sigma-Aldrich，美国）溶于DMSO后稀释至终浓度5×10^-5 mol/L。细菌于LB培养基培养至对数期，分装至96孔板后加入8-MOP，以365 nm UVA照射不同时间（0–12 min），照射后37°C孵育90 min，使用StatFax 4400发光计测量相对发光单位（RLU）。采用分段回归（R程序segmented 2.2-1）分析剂量-反应曲线的非线性动态，识别拐点。

**研究结果**

**1. Induction of 8-MOP reactive oxygen species in bacterial cells.**
通过pSoxS-lux和pKatG-lux生物传感器，研究人员发现8-MOP+UVA照射4 min后，pSoxS-lux发光强度即超对照约4倍，表明超氧阴离子（O₂^-）快速形成；8 min后信号趋于稳定（拐点7.35 min）。pKatG-lux发光随照射时间近线性增加，12 min时总增幅约6.6倍，拐点4.0 min，反映过氧化物（H₂O₂）持续积累且未达饱和。两种动力学差异提示soxS启动子激活先于katG启动子，与OxyR系统对H₂O₂阈值的要求一致。

**2. Induction of DNA damages in bacterial cells by 8-MOP.**
pRecA-lux生物传感器在4 min时发光为对照的2.2倍，6 min后增速放缓（拐点5.39 min），表明DNA损伤（单加合物、二加合物）诱导SOS应答，但recA启动子基础表达较高。pColD-lux生物传感器在4 min时信号急剧上升（27,245 RLU），10 min时出现拐点，总增幅达40倍，显著高于pRecA-lux。这表明colD(cda)启动子对DNA损伤（尤其是链间交联）及可能伴随的膜损伤具有更高灵敏度和信号放大效应。

**讨论与结论**

讨论部分指出，8-MOP+UVA通过光化学反应产生单线态氧（¹O₂），进而生成超氧阴离子和过氧化物，后者在Fenton反应中产生羟基自由基（•OH）。pSoxS-lux和pKatG-lux的动力学差异反映细胞内ROS响应顺序：SoxR/SoxS系统对超氧阴离子快速反应，而OxyR系统对H₂O₂需要累积阈值。pRecA-lux和pColD-lux的对比表明，recA启动子对DNA损伤敏感但基础表达高，colD启动子则仅在DNA损伤累积至临界水平时强烈激活，且对膜结构扰动等非特异性胁迫也有响应。研究结论：本研究首次通过实时记录大肠杆菌生物传感器中soxS和katG的表达，直接证明8-MOP+UVA诱导ROS；pSoxS-lux和pKatG-lux动力学差异显著，反映启动子激活顺序；pRecA-lux和pColD-lux在DNA损伤下激活，但后者灵敏度更高；colD(cda)启动子相比recA、soxS和katG启动子，表现出更宽的敏感性和明显的信号放大效应。