CAPAH的开发与临床应用：一种用于新生儿苯丙酮尿症精准二级筛查的长读长测序技术

《Orphanet Journal of Rare Diseases》：Development and clinical application of CAPAH: a long-read sequencing approach for accurate second-tier screening of phenylketonuria in newborns

　　

摘要

背景

苯丙酮尿症（PKU）是一种常见的新生儿遗传性代谢疾病。早期诊断和及时干预对于预防神经发育障碍至关重要。传统的新生儿筛查主要通过检测血液中的苯丙氨酸水平，但这可能导致假阳性和假阴性结果。长读长测序技术具有高覆盖度和长片段解析能力，能够全面检测PAH基因变异，从而有望提升PKU的筛查和诊断效率。

方法

我们基于HiFi长读长测序平台开发了一种全面的PAH基因测序技术（CAPAH），并将其应用于新生儿的PKU二级筛查。首先，在20个已知基因型的样本中验证了CAPAH与传统NGS、MLPA及桑格测序结果的一致性。随后，对200名初次筛查结果为阳性或临界值的新生儿进行了回顾性分析，以评估CAPAH在变异检测、基因型与表型关联以及二级筛查效果方面的作用。

结果

在20个验证样本中，CAPAH与传统方法的检测结果完全一致（100%）。该技术能够直接确定顺反子构型，并精确定位大型缺失突变位点。在200名新生儿中，CAPAH检测出103名存在双等位基因变异的新生儿、47名携带者以及50名阴性个体，使得初次筛查后的召回率降低了48.5%（97/200）。在131名初次筛查阴性或因再次检测苯丙氨酸水平而被排除PKU可能的新生儿中，CAPAH又检测出40名携带复合杂合变异的新生儿，避免了约20%的潜在漏检情况。在103名存在双等位基因变异的新生儿中，CAPAH共检测出64种PAH基因变异，其中包括47种错义变异、8种剪接位点变异、4种无义变异以及5种缺失变异。基因型与表型分析显示，再次检测呈阳性的组中严重双等位基因PKU相关变异（经典型及轻度PKU）的比例明显高于再次检测呈阴性的组（25.00%对比14.29%）。c.158G＞A基因型的纯合状态，或该基因型与PKU或轻度高苯丙氨酸血症相关变异共同存在时，会导致血液苯丙氨酸水平处于2–6 mg/dL的轻度高苯丙氨酸血症范围。而当c.158G＞A基因型与PKU相关变异同时存在时，再次检测的苯丙氨酸水平会显著升高（p＜0.01）。

结论

CAPAH能够全面检测PAH基因，包括复杂的变异类型及顺反子构型，从而提升新生儿PKU二级筛查的准确性，减少不必要的召回。这是一种高效实用的分子诊断工具，可用于遗传性代谢疾病的新生儿筛查。