传染性法氏囊病病毒通过线粒体caspase-9/3通路在DF-1细胞中诱导GSDME依赖的细胞焦亡

《Veterinary Research》：Infectious bursal disease virus induces GSDME-dependent pyroptosis via the mitochondrial caspase-9/3 pathway in DF-1 cells

　　

传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种重要的禽类病原体，损害法氏囊并持续威胁家禽业。细胞焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡，但其对IBDV诱导的细胞损伤的贡献尚未完全明确。这里，使用DF-1细胞，研究人员发现IBDV感染与caspase-3激活、gasdermin E（GSDME）的裂解、成孔N端片段（GSDME-N）的产生、乳酸脱氢酶释放增加、质膜损伤以及炎症细胞因子相关读数的增强（包括白细胞介素-1β（IL-1β）分泌增加和IL-18信使RNA（mRNA）表达升高）相关。IBDV感染还诱导线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位（ΔΨm）丧失、活性氧产生增加和caspase-9激活，支持线粒体相关caspase-9/3通路的参与。caspase-9或caspase-3的药理学抑制减少了焦亡相关读数，表明在测试条件下线粒体损伤有助于IBDV诱导的裂解性细胞死亡。单独表达病毒蛋白（VP）2或VP5可引起可检测的细胞毒性，但不能强烈再现GSDME裂解，表明病毒蛋白可能有助于感染期间进一步放大的上游细胞应激。总之，这些发现支持IBDV通过线粒体相关caspase-9/3-GSDME轴在DF-1细胞中促进焦亡样裂解性细胞死亡。

传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种严重危害家禽业的病原体，主要损伤法氏囊并导致免疫抑制。传统观点认为IBDV诱导的细胞死亡以凋亡为主，但细胞焦亡（一种炎症性程序性细胞死亡）在其中的作用尚不清晰。本研究旨在探讨IBDV是否通过线粒体相关caspase-9/3通路激活gasdermin E（GSDME）依赖的细胞焦亡，并分析病毒蛋白VP2和VP5的贡献。该研究发表在《Veterinary Research》。

研究人员利用DF-1鸡胚成纤维细胞系，通过IBDV B87疫苗株感染，结合siRNA敲低、药理学抑制剂、质粒过表达等技术，系统评估了细胞活力、膜完整性、线粒体功能、caspase活性及GSDME裂解。主要技术方法包括：Annexin V/PI流式细胞术检测膜损伤；LDH释放与CCK-8评估细胞毒性；JC-1与MitoSOX染色检测线粒体膜电位（ΔΨ_m）和活性氧（ROS）；Western blot检测GSDME裂解；qPCR与ELISA检测炎症因子表达；以及caspase-3/9活性测定。样本来源为广西北大学实验室保存的细胞适应株，无野外强毒株分类。

研究结果如下：
1. **IBDV感染降低DF-1细胞活力并破坏质膜完整性**：Annexin V/PI流式显示PI阳性细胞随时间增加，CCK-8细胞活力从24 h起显著下降，LDH释放呈剂量和时间依赖性升高，共聚焦显微镜观察到质膜形态破坏，提示裂解性细胞死亡表型。
2. **IBDV诱导GSDME依赖的细胞焦亡，伴随炎症细胞因子反应**：ELISA检测到IL-1β分泌增加，qPCR显示IL-1β和IL-18 mRNA上调，GSDME mRNA表达上升，Western blot观察到GSDME N端片段（GSDME-N）生成；siRNA敲低GSDME减少LDH释放和PI阳性细胞，而过表达GSDME增强LDH释放，证实GSDME依赖的焦亡。
3. **IBDV激活caspase-3裂解GSDME并促进焦亡样裂解死亡**：caspase-3活性升高，caspase-3 mRNA上调；caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK显著减少GSDME裂解，提高细胞活力，降低LDH释放和PI阳性细胞。
4. **caspase-9活性参与IBDV诱导的膜破裂和裂解性死亡**：caspase-9活性和mRNA表达增加；caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK减少PI阳性细胞，部分恢复细胞活力，降低LDH释放，表明caspase-9位于caspase-3/GSDME轴的上游。
5. **VP2和VP5引起IBDV相关细胞毒性并产生caspase抑制剂敏感的损伤**：单独表达VP2或VP5增加Annexin V/PI阳性细胞，引起质膜形态改变，但未检测到GSDME-N；两者均增加LDH释放、降低细胞活力，共表达加剧效应；caspase-3或caspase-9抑制剂部分缓解这些损伤。
6. **线粒体功能障碍参与IBDV及VP2/VP5相关的裂解性损伤**：JC-1染色显示红色/绿色荧光比值下降（ΔΨ_m降低），MitoSOX检测到ROS增加；线粒体分裂抑制剂Mdivi-1减少LDH释放、PI阳性细胞，部分恢复细胞活力，提示线粒体应激是裂解性死亡的上游驱动因素。

讨论部分总结：本研究在DF-1细胞中证实IBDV通过线粒体相关caspase-9/3-GSDME轴诱导焦亡样裂解性死亡，这一过程不同于经典凋亡，并伴有炎症因子释放。VP2和VP5虽然可引起细胞毒性，但单独表达不足以强力激活GSDME，提示完整病毒复制提供的线粒体应激和免疫信号是充分激活该轴的关键。线粒体功能障碍可能通过放大caspase激活和GSDME裂解而促进死亡。研究结论翻译：总体而言，研究人员的结果确定线粒体相关caspase-9/3-GSDME轴是IBDV在DF-1细胞中诱导裂解性损伤的重要贡献者。该通路可能影响炎症介质释放和病毒相关组织损伤。因此，干扰线粒体应激或caspase/GSDME信号值得在后续研究中探索，但该机制的生理相关性需要在更相关的细胞类型和体内模型中建立。