WaaL–WaaP受体交叉对话驱动鸡白痢沙门氏菌中噬菌体诱导的对黏菌素的协同敏感性

《Veterinary Research》：WaaL–WaaP receptor cross-talk drives phage-induced collateral sensitivity to colistin in Salmonella Pullorum

　　

噬菌体疗法通常因细菌快速进化出耐药性而失败，但逃逸突变体不可避免的适应性代价仍未得到充分利用。在本研究中，研究人员提出并开发了一种迭代靶向噬菌体鸡尾酒配方策略（ITPFS）。首先针对一株黏菌素耐药鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pullorum）分离到一株强效裂解性噬菌体PHZ055。共培养至出现耐药突变体后，针对该耐药变异株筛选出第二株裂解性噬菌体PYW047_3。然后将两株噬菌体组合成鸡尾酒。结果显示细菌生长被强烈抑制，耐药性的出现被显著延迟。受体鉴定表明两种噬菌体均以脂多糖（LPS）为受体，但结合位点不同：PHZ055靶向WaaL，PYW047_3靶向WaaP。WaaL突变导致聚合O抗原单元丢失，从而暴露PYW047_3结合区域，表明靶向不同受体位点的噬菌体鸡尾酒可被定向筛选。此外，逃逸两种噬菌体的突变体不仅产生生长代价，还对黏菌素敏感性提高了32倍。将两种噬菌体与1/4 MIC黏菌素联合使用，在24小时内几乎完全清除所有细菌。总之，该研究成功提供了一种可重复的策略，融合适应性代价以提升治疗效果。

鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pullorum）是专性感染禽类的病原体，在雏鸡中引起急性败血症，在成年鸡中导致慢性无症状感染并损害生殖系统，可导致高达近100%的死亡率，尤其在亚洲造成重大经济损失。随着抗菌药物耐药性（AMR）的上升，噬菌体被视为对抗耐药菌株的有效武器，但细菌快速进化出噬菌体耐药性仍限制其疗效。然而，噬菌体诱导的耐药突变通常伴随适应性代价，如生长缺陷、毒力减弱、对抗生素敏感性增加等。因此，战略性利用这些代价有望改善噬菌体疗法的临床效果。

为解决噬菌体耐药瓶颈，研究人员开展了一项研究，旨在开发一种迭代靶向噬菌体鸡尾酒配方策略（ITPFS），并利用适应性代价（尤其是对黏菌素的协同敏感性）来增强治疗效果。该研究从江苏省某鸡场死鸡胚中分离出多重耐药（MDR）致病性鸡白痢沙门氏菌菌株HZ055，并以此为基础，从城市养鸡场废水中分离出两株裂解性噬菌体：PHZ055和PYW047_3。通过两轮迭代筛选，将两者组合成噬菌体鸡尾酒，显著抑制了细菌生长并延迟了耐药性出现。研究发现，两种噬菌体均以脂多糖（LPS）为受体，但结合位点不同：PHZ055靶向WaaL（负责O抗原连接的酶），PYW047_3靶向WaaP（负责LPS核心区庚糖磷酸化的激酶）。WaaL突变导致O抗原丢失，从而暴露PYW047_3的结合区域，揭示了受体交叉对话机制。此外，逃逸两种噬菌体的突变体（R2P）不仅表现出生长缺陷和毒力减弱，还对黏菌素敏感性提高了32倍（MIC从2 μg/mL降至0.0625 μg/mL）。将噬菌体鸡尾酒与1/4 MIC黏菌素联合使用，在24小时内几乎完全清除细菌，并在蜡螟（Galleria mellonella）感染模型中表现出显著的保护效果。该研究发表于《Veterinary Research》。

主要关键技术方法包括：样本队列来源于江苏省某鸡场死鸡胚，分离出HZ055和YW047菌株；通过双层琼脂平板法、透射电子显微镜（TEM）和基因组测序（Illumina HiSeq 2500和Oxford Nanopore MinION）对噬菌体进行形态观察和特性分析；利用全基因组测序和Sanger测序鉴定噬菌体耐药突变体中的突变位点；构建基因敲除和回补菌株（使用自杀质粒pRE112和pBAD44载体）以验证受体功能；通过噬菌体吸附效率测定（EOP）和吸附效率实验确认受体特异性；采用肉汤微量稀释法测定抗生素最小抑菌浓度（MIC）；通过时间-杀菌曲线评估噬菌体-抗生素联合疗效；利用蜡螟感染模型评估毒力；通过扫描电子显微镜（SEM）观察细菌表面形态；通过荧光探针（Disc3(5)、Laurdan、PI、NPN）测定膜电位、膜流动性和膜通透性；通过定量实时PCR（qPCR）分析黏菌素耐药相关基因（pmrA、pmrB、arnT、eptA、pmrD、pmrG、pmrR）的表达水平。

研究结果如下：

**1. ITPFS的建立及双噬菌体鸡尾酒疗效**：通过两轮筛选，从噬菌体库中分别获得针对HZ055及其耐药突变体055R的强效裂解性噬菌体PHZ055和PYW047_3。将两者组合成鸡尾酒后，与单用PHZ055相比，细菌生长被强烈抑制，耐药性出现显著延迟，表明该策略有效。

**2. PHZ055和PYW047_3的形态、生物学及基因组分析**：TEM显示PHZ055为长尾噬菌体科（siphovirus），具有长非收缩尾；PYW047_3为肌尾噬菌体科（myovirus），具有可收缩尾鞘。基因组分析表明两者分别属于Jerseyvirus属和Felixounavirus属，均不含AMR或毒素基因。PYW047_3编码18个tRNA，可能增强其翻译效率和感染能力。一步生长曲线显示PHZ055的裂解量约为100 PFU/细胞，PYW047_3约为20 PFU/细胞。

**3. 噬菌体耐药突变体中的多样化突变**：全基因组测序显示，PHZ055耐药突变体（055R）在yehA（编码菌毛蛋白）和waaL（编码O抗原连接酶）基因中均存在单核苷酸插入突变。PYW047_3耐药突变体（047R）在yehA基因中存在单核苷酸插入，并在waaP（编码LPS核心庚糖磷酸激酶）基因中存在片段缺失，同时在rfaJ基因中存在错义突变。

**4. 受体WaaL和WaaP介导交叉裂解敏感性**：基因敲除实验表明，HZ055中waaL缺失完全消除PHZ055的感染能力（EOP下降约10⁶倍），而yehA缺失仅降低100倍；YW047中waaP缺失完全消除PYW047_3的感染能力，而rfaJ缺失仅降低10倍。回补实验部分或完全恢复敏感性。吸附实验进一步证实，PHZ055对HZ055ΔwaaL的吸附效率显著降低，而PYW047_3对HZ055ΔwaaL的吸附效率反而升高约40%，表明waaL突变暴露了PYW047_3的结合位点。

**5. 双噬菌体组合诱导多种适应性代价**：生长曲线显示，HZ055ΔwaaL、055R和R2P菌株均出现显著生长缺陷，其中R2P最为严重。蜡螟感染模型表明，HZ055ΔwaaL、YW047ΔwaaP、055R和R2P菌株的毒力显著减弱（36小时生存率>30%），而野生型HZ055和YW047在24小时内致死率达100%。SEM观察发现，HZ055ΔwaaL和055R表面粗糙、有孔隙，R2P还出现细胞黏附和塌陷。膜电位、膜通透性和膜流动性检测显示，R2P和YW047ΔwaaP表现出显著膜损伤，而055R和HZ055ΔwaaL变化不显著，表明双噬菌体组合诱导更广泛的膜功能障碍。

**6. 对黏菌素的协同敏感性及协同疗效评估**：MIC测定显示，055R和HZ055ΔwaaL对黏菌素的MIC降低4倍（至0.5 μg/mL），而047R、R2P和YW047ΔwaaP降低32倍（至0.0625 μg/mL）。时间-杀菌曲线显示，噬菌体鸡尾酒（2P）与1/4 MIC黏菌素联合使用，在24小时内完全抑制细菌生长，OD₆₀₀值维持在初始水平。蜡螟模型中，该三联组合在24小时生存率超过70%，显著优于其他组。qPCR分析表明，HZ055ΔwaaL和YW047ΔwaaP中多个Pmr系统基因（如pmrD、pmrG、arnT等）显著上调，而055R和R2P中这些基因表达变化较小，提示膜通透性增加可能也是黏菌素敏感性恢复的机制。

讨论部分：研究人员总结，本研究成功验证了ITPFS策略，通过定向筛选靶向不同LPS表位的噬菌体（PHZ055靶向O抗原，PYW047_3靶向核心庚糖），并利用适应性代价（协同敏感性）增强疗效。该策略具有广谱应用潜力，可扩展至其他临床MDR细菌。研究结论翻译如下：总之，本研究报告并验证的ITPFS确实有助于筛选出PHZ055和PYW047_3两种噬菌体。waaL突变消除PHZ055的受体（O抗原）同时暴露PYW047_3的受体（庚糖核心）这一观察结果，不仅验证了受体鉴定的特异性，也阐明了它们相互作用的机制基础。这种相互作用模式进一步支持了由靶向这些交互调控的LPS表位的噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒的方向性筛选。此外，不可避免的适应性代价（即本研究中黏菌素的协同敏感性）也被整合并利用以增强治疗效果。至关重要的是，该策略显示出有前景的广谱适用性，并可轻松扩展到其他临床代表性MDR细菌分离株。