《Frontiers in Endocrinology》：Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors suppress myofibroblastic differentiation and hyaluronan synthesis in Graves’ orbitopathy fibroblasts
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摘要翻译：Graves眼病（GO）以眼眶组织炎症、透明质酸积聚、组织扩张及纤维化为特征，目前有效的抗纤维化药物治疗手段仍然有限。二肽基肽酶-4抑制剂（DPP4i）广泛用于2型糖尿病，已有研究报道其可在多个器官中调节成纤维细胞活性和纤维化反应。本研究探讨了DPP
摘要翻译：Graves眼病（GO）以眼眶组织炎症、透明质酸积聚、组织扩张及纤维化为特征，目前有效的抗纤维化药物治疗手段仍然有限。二肽基肽酶-4抑制剂（DPP4i）广泛用于2型糖尿病，已有研究报道其可在多个器官中调节成纤维细胞活性和纤维化反应。本研究探讨了DPP4i对人原代眼眶成纤维细胞的影响，并评估其在GO中的潜在相关性。眼眶成纤维细胞取自GO患者及非GO对照组。通过Western blotting评估DPP4蛋白表达。分别采用DAPI细胞核计数、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光及Western blotting、油红O染色和ELISA评估利格列汀和西格列汀对成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞分化、脂肪生成及透明质酸产生的影响。在GO组和非GO组的眼眶成纤维细胞中均检测到DPP4蛋白。利格列汀和西格列汀显著降低了GO成纤维细胞中转化生长因子-β（TGF-β）诱导的α-SMA表达，而在非GO成纤维细胞中其作用较弱。利格列汀和西格列汀均显著抑制了GO和非GO成纤维细胞中白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的透明质酸产生。两种抑制剂均未显著改变两组的DAPI细胞计数或脂质积聚。这些发现提供了体外证据，表明DPP4i能够调节与肌成纤维细胞分化和细胞因子诱导的透明质酸产生相关的眼眶成纤维细胞表型。尚需进一步的机制学、药代动力学、体内及临床研究来阐明其与GO相关组织重塑的相关性。
论文解读文章：
Graves眼病（Graves' orbitopathy, GO）又称甲状腺眼病或甲状腺相关眼眶病，是Graves病（Graves' disease, GD）最常见的甲状腺外表现，约40%的GD患者受累，也可发生于甲状腺功能正常的自身免疫性甲状腺炎患者。GO的发病机制涉及自身免疫反应攻击眼眶结缔组织，眼眶组织中出现T细胞、单核细胞、巨噬细胞和B细胞浸润，这些免疫细胞与抗促甲状腺激素受体抗体相互作用，通过受体交叉对话激活IGF-1R，并释放包括白细胞介素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素-γ在内的炎症细胞因子，加剧炎症和纤维化。眼眶成纤维细胞是GO病理过程的核心效应细胞，其通过分泌细胞因子、产生过量透明质酸、发生脂肪生成以及分化为肌成纤维细胞，驱动水肿、组织扩张和纤维化。GO的临床表现从眼周红肿到眼球突出、眼睑退缩、眼外肌功能障碍，严重时可出现压迫性视神经病变。传统观点认为GO呈双相临床病程，先为活动性炎症阶段，后进入以组织重塑和纤维化为特征的非活动期；但新近证据表明纤维化并非仅限于晚期非活动期，可能在疾病早期即作为炎症过程的一部分出现，反映组织修复反应。一旦眼外肌和眼眶结缔组织形成纤维化，功能恢复和治疗反应性均受限。目前一线治疗主要针对活动期炎症，如静脉糖皮质激素，以及新兴生物制剂teprotumumab和tocilizumab，但这些药物存在不良反应（如糖皮质激素肝毒性、teprotumumab相关听力损失或高血糖、tocilizumab增加感染风险），且对已建立的纤维化缺乏有效干预。因此，针对GO眼眶组织重塑和纤维化潜在机制的疗法存在未满足的临床需求。
二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4, DPP4）是一种具有蛋白酶活性的膜糖蛋白，表达于上皮细胞、淋巴细胞和成纤维细胞等多种细胞，也以可溶性形式存在于血清中。DPP4除调节葡萄糖代谢外，还参与炎症和免疫应答调控，与自身免疫病发病相关。已有研究报道GD和GO患者血清DPP4水平改变，提示其参与疾病发生。此外，DPP4在肾、肝、心和皮肤等器官中通过炎症和成纤维细胞激活促进纤维化。DPP4抑制剂（DPP4i）自2006年起获批用于2型糖尿病，耐受性良好且低血糖风险低，除降糖外还具有抗炎、抗凋亡和免疫调节作用，有证据表明其可在多种组织中预防或逆转纤维化。鉴于GO涉及炎症驱动的纤维化，研究人员假设DPP4i的抗炎和抗纤维化特性可能有益于GO患者，故开展本研究以评估DPP4i对眼眶成纤维细胞行为的影响。
研究人员从台湾大学医学院附设医院招募接受眼眶减压手术的GO患者和无GO的健康对照（接受美容眼睑手术），共纳入10例GO患者和10例非GO对照。GO组患者均处于甲状腺功能正常状态，临床活动性评分（clinical activity score, CAS）较低（1~3分），其中2例在手术前3个月内接受过糖皮质激素治疗，无其他免疫调节剂使用史。研究经伦理委员会批准并遵循赫尔辛基宣言。主要关键的技术方法包括：原代眼眶成纤维细胞分离培养（胶原酶消化法，使用第2至第5代细胞）；Western blotting检测DPP4、α-SMA、磷酸化Smad3（p-Smad3）和总Smad3蛋白表达；DAPI细胞核计数评估细胞增殖；α-SMA免疫荧光染色及定量评估肌成纤维细胞分化；油红O（Oil Red O, ORO）染色评估脂肪生成；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测透明质酸水平。研究中使用利格列汀（1 μM）和西格列汀（20 μM）两种DPP4i，浓度基于预实验及既往体外研究选择。
研究结果分五个部分。第一，DPP4在眼眶成纤维细胞中的表达：Western blot检测显示，GO和非GO供体的眼眶成纤维细胞中均存在DPP4蛋白，无论是否经TGF-β处理48小时。在GO成纤维细胞中，TGF-β刺激使DPP4表达呈非显著升高趋势；而在供体匹配分析中，非GO成纤维细胞经TGF-β处理后DPP4显著上调。第二，DPP4i不影响眼眶成纤维细胞增殖：经利格列汀或西格列汀处理48小时后，GO组和非GO组的DAPI阳性细胞核数量均无显著差异。第三，DPP4i显著抑制GO组的肌成纤维细胞分化：TGF-β刺激显著增加GO和非GO组成纤维细胞的α-SMA表达；利格列汀和西格列汀均显著降低GO成纤维细胞中TGF-β诱导的α-SMA表达，而在非GO成纤维细胞中西格列汀仅呈非显著降低趋势。Western blot验证实验（5例GO供体）显示，TGF-β增加α-SMA蛋白表达，西格列汀在所有5例供体中均呈现一致的降低趋势，利格列汀作用较弱且变异较大，但均未达统计学显著性。进一步在3例GO供体亚组中检测TGF-β/Smad信号，发现TGF-β显著增加p-Smad3/Smad3比值，利格列汀和西格列汀均显著降低TGF-β诱导的p-Smad3/Smad3比值。第四，DPP4i不影响油红O评估的脂肪生成：在GO和非GO成纤维细胞中，利格列汀或西格列汀处理12天后脂滴积聚均无显著变化。第五，DPP4i抑制IL-1β诱导的透明质酸产生：IL-1β刺激显著增加GO和非GO成纤维细胞的透明质酸产生，利格列汀和西格列汀共处理均显著抑制了两组细胞中IL-1β诱导的透明质酸产生。
讨论部分指出，这是首次在GO患者来源的原代眼眶成纤维细胞中研究DPP4i的作用，特别是对肌成纤维细胞分化和透明质酸合成的影响。DPP4在眼眶成纤维细胞中的表达提示其与成纤维细胞相关过程存在潜在关联。非GO成纤维细胞在TGF-β刺激后DPP4显著上调，与DPP4作为TGF-β反应性标志物一致；GO成纤维细胞仅呈轻度趋势，可能反映疾病相关微环境的差异以及眼眶成纤维细胞亚群的固有多样性。DPP4i显著降低GO成纤维细胞α-SMA表达，与既往在系统性硬化症、青光眼术后Tenon囊成纤维细胞以及肝、肾、心等器官中观察到的抗纤维化作用一致。亚组分析显示DPP4i可能通过抑制Smad3磷酸化来减弱TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化，但样本量小，需更大规模研究确认。非GO成纤维细胞中DPP4i未显著抑制α-SMA，可能与CD90+（Thy-1+）成纤维细胞及PDGFRα+DPP4+成纤维细胞亚群在GO组织中的富集和不同反应性有关，但本研究未直接表征成纤维细胞亚群。DPP4i不影响增殖和脂肪生成，提示眼眶成纤维细胞的脂肪生成可能主要依赖PPARγ等非DPP4相关通路，但研究中未检测PPARγ和FABP4等脂肪生成标志物，且DAPI计数不能直接评估DNA合成或细胞周期进展。DPP4i抑制IL-1β诱导的透明质酸产生，鉴于透明质酸失调是组织纤维化的上游驱动因素并参与GO水肿和基质扩张，这一作用可能对GO眼眶组织重塑具有潜在意义。研究存在局限性：样本量较小、体外模型不能完全模拟GO眼眶微环境中复杂的细胞因子和免疫细胞相互作用、未检测DPP4i的完整药效学范围、体外扩增可能存在表型漂移、所用DPP4i浓度属于药理学体外剂量不等同于临床眼眶组织暴露水平。研究结论为：DPP4i选择性抑制眼眶成纤维细胞中肌成纤维细胞分化和透明质酸产生的标志物，而不显著影响成纤维细胞增殖或脂质积聚，这种效应可能有利于在不广泛损害成纤维细胞生理功能的情况下减轻组织纤维化和扩张；但DPP4i对GO的临床影响尚待确定，需要进一步的机制学、药代动力学、体内和转化研究来阐明DPP4i在GO中的临床相关性。该论文发表在《Frontiers in Endocrinology》。
