针对禽偏肺病毒的新型亚单位疫苗候选株的研制及其免疫原性

《Frontiers in Veterinary Science》：Development and immunogenicity of a novel subunit vaccine candidate against avian metapneumovirus

　　

摘要目的：尽管广泛实施了疫苗接种计划，禽偏肺病毒（aMPV）B亚型仍然是影响全球商品家禽的主要呼吸道病原体之一。在本研究中，研究人员针对新开发的aMPV B亚型亚单位疫苗进行了流行病学监测、病毒分离和免疫原性评价。方法：采用多重实时逆转录聚合酶链反应（multiplex real-time RT-PCR）对来自哈萨克斯坦三个地区16个商品家禽养殖场的115个鸡群进行了aMPV B亚型筛查。春季采集的样本中约20%检测为aMPV阳性，其中B亚型在检测到的毒株中占主导地位。系统发育分析显示，鉴定出的病毒聚类于B亚型，与疫苗样毒株密切相关，同时形成一个独特的单系群。对于病毒分离，对传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡毒支原体检测为阴性的田间样本在Vero细胞中进行增殖。经过3–4代后观察到细胞病变效应，并从一只产蛋鸡中成功获得一株分离株，命名为Ck/B/Kaz/256/25。随后通过电子显微镜和凝胶电泳对该分离株进行了确认，并用于亚单位疫苗的开发。结果：采用初免–加强免疫方案在鸡中评估了疫苗的免疫原性，并与商品化活疫苗进行了比较。亚单位疫苗在接种后第14天诱导了100%血清转换，并引发了显著高于活疫苗的IgG和病毒中和抗体滴度。与活疫苗组相比，初免后中和抗体滴度高出8倍，加强免疫后高出16倍。此外，亚单位疫苗显著增强了γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的表达，表明Th1和Th2介导的免疫应答均被激活。结论：总体而言，这些发现表明，所开发的亚单位疫苗可诱导强效且持久的体液和细胞免疫应答，是预防和控制家禽aMPV B亚型感染的有前景的候选疫苗。

论文解读文章

**研究背景**
禽偏肺病毒（avian metapneumovirus, aMPV）B亚型是商品家禽中最重要的呼吸道病原体之一，可导致火鸡鼻气管炎、鸡肿头综合征、产蛋量下降、生长迟缓和继发感染易感性增加，给全球家禽业造成显著经济损失。尽管广泛应用活疫苗和灭活疫苗，但现有疫苗存在明显不足：活疫苗可能引起接种后呼吸道反应、对抗原性差异的田间毒株保护效力有限，并存在毒力返强的风险；灭活疫苗虽安全性较高，但通常诱导较弱的黏膜和细胞免疫应答，需多次加强免疫以维持长期保护。此外，aMPV B亚型流行株的遗传多样性加剧了交叉保护免疫的诱导难度，使病毒在高密度家禽生产系统中持续循环。因此，开发安全、高效且能诱导平衡免疫应答的新型疫苗策略具有重要现实意义。本研究基于流行病学监测、病毒分离和亚单位疫苗构建，旨在评估一种以纯化病毒糖蛋白为抗原的亚单位疫苗候选株在家禽中的免疫原性，相关成果发表于《Frontiers in Veterinary Science》。

**研究内容与结论**
研究人员在哈萨克斯坦三个地区的16个商品家禽养殖场，对115个鸡群（包括肉鸡、肉种鸡和蛋鸡）进行了aMPV B亚型分子监测。通过多重实时逆转录聚合酶链反应（multiplex real-time RT-PCR）检测，春季样本阳性率约为20%，且所有阳性毒株均属于B亚型。系统发育分析基于融合（F）基因核苷酸序列，显示哈萨克斯坦分离株与疫苗样毒株密切相关，但形成独立单系群，提示区域遗传分化。从一例蛋鸡样本中成功分离到一株病毒（Ck/B/Kaz/256/25），经透射电子显微镜和电泳分析确认其形态与蛋白组成。该分离株用于制备亚单位疫苗：采用MEGA-10去垢剂提取病毒糖蛋白，与Montanide ISA 70 VG佐剂乳化形成水包油乳液，抗原含量为10 μg/剂。

**关键技术与方法**
主要技术方法包括：样本队列来源为哈萨克斯坦16个商品农场的115个鸡群（含肉鸡、肉种鸡、蛋鸡）；多重实时RT-PCR检测aMPV B亚型；Vero细胞病毒分离与传代；透射电子显微镜观察病毒形态；SDS-PAGE与Western blot分析糖蛋白纯度与抗原性；MEGA-10去垢剂提取糖蛋白；Montanide ISA 70 VG佐剂制备水包油乳剂；7日龄鸡初免–加强免疫方案（3周间隔）；IDEXX ELISA试剂盒检测血清IgG抗体；Vero细胞病毒中和试验测定中和抗体滴度；Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs）；实时定量RT-PCR（qRT-PCR）检测IFN-γ和IL-4 mRNA表达，以28S rRNA为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量；F基因测序与邻接法系统发育分析。

**研究结果**
**检测与分离禽偏肺病毒**：115个鸡群中23个（20.0%）检测为aMPV B亚型阳性，春季阳性率最高。病毒分离仅从一例蛋鸡样本成功获得一株病毒（Ck/B/Kaz/256/25），电镜确认其典型包膜形态，SDS-PAGE显示蛋白条带，显示该分离株可用于疫苗制备。
**亚单位疫苗的制备**：MEGA-10处理获得糖蛋白组分，SDS-PAGE和免疫印迹证实其纯度和抗原性。疫苗制剂为稳定水包油乳液，抗原结合效率为94.0±0.2%，室温下物理性质稳定，经滤膜除菌，4℃存储期间无相分离或沉淀。
**血清IgG抗体水平**：亚单位疫苗组在初免后第14天实现100%血清转换，而活疫苗组在第14天仅60%，第21天达100%。亚单位疫苗组第21天平均IgG抗体滴度达120,000，显著高于活疫苗组的40,000。加强免疫后，抗体滴度无显著升高，但亚单位疫苗组高抗体水平持续至第168天，而活疫苗组降至20,000。表明亚单位疫苗诱导更早、更持久且更强的体液免疫应答。
**病毒中和抗体水平**：两组在接种后第7天均检测到中和抗体，第21天100%阳性。亚单位疫苗组初免后几何平均滴度为9.0 log₂，活疫苗组为6.0 log₂（约8倍差异）；加强免疫后分别为9.2 log₂和4.2 log₂（约16倍差异）。对照组始终阴性。结果提示亚单位疫苗有效保留了诱导功能性中和抗体的免疫优势表位。
**Th1和Th2相关细胞因子表达**：亚单位疫苗组PBMCs中IFN-γ mRNA表达水平约为对照组的16倍，活疫苗组的4倍；加强免疫后进一步升高约2倍。IL-4表达呈现相似模式。表明亚单位疫苗同时激活Th1（抗病毒细胞免疫）和Th2（体液免疫辅助）应答，且强度显著高于活疫苗。

**讨论与结论**
讨论部分强调，亚单位疫苗诱导的早期血清转换、高滴度中和抗体及持续抗体水平，表明其抗原活性强且能快速启动适应性免疫。与活疫苗相比，亚单位疫苗在关键免疫参数上全面优势，且通过激活IFN-γ和IL-4实现了平衡的Th1/Th2反应，这对于有效抗病毒保护至关重要。研究也存在局限性：未在攻毒模型下评估保护效力，未在商品农场条件下验证，黏膜免疫指标（如分泌型IgA）未纳入，且仅使用单一分离株，交叉保护性未知。尽管如此，综合结果表明，该亚单位疫苗具有强免疫原性，是预防aMPV B亚型感染的有前景候选疫苗。
**研究结论**：本研究表明，所开发的针对aMPV B亚型的亚单位疫苗在接种鸡中诱导了强效且持久的免疫应答，并在多个关键免疫学参数上优于活疫苗。亚单位疫苗促进了更早的血清转换，产生了显著更高水平的特异性IgG和病毒中和抗体，并在免疫后长时间内维持高抗体滴度。除增强的体液免疫外，该疫苗还刺激了Th1和Th2相关免疫应答，表现为IFN-γ和IL-4细胞因子表达升高。细胞免疫和体液免疫的同时激活表明建立了平衡且全面的免疫应答，这对于有效的抗病毒保护至关重要。总体而言，这些发现凸显了所开发亚单位疫苗的强免疫原性潜力，支持其作为预防家禽aMPV B亚型感染的有前景候选疫苗。进一步研究包括攻毒实验和田间评估，以确认其保护效力和在商品家禽生产条件下的实际应用价值。