ΔtssB-EP作为抗嗜鱼爱德华氏菌活减毒疫苗的开发与初步评价

《Frontiers in Immunology》：Development and preliminary evaluation of a ΔtssB-EP as a live attenuated vaccine against Edwardsiella piscicida

　　

背景：疫苗接种是水产养殖中预防和控制传染病最有效的策略。嗜鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida），一种革兰氏阴性兼性胞内细菌病原体，是鱼类爱德华氏菌病的病原体，该疾病在水产养殖业中导致显著的发病率和死亡率以及经济损失。方法：在本研究中，研究人员通过等位交换方法，从毒力嗜鱼爱德华氏菌中构建了一个活减毒突变株，命名为ΔtssB-EP，该突变株通过框内缺失编码VI型分泌系统（T6SS）组分的tssB基因而获得。研究人员进行了一系列体外和体内研究，以评估所开发的突变株作为有效疫苗候选的潜力。结果：通过聚合酶链反应（PCR）确认了约506 bp的精准缺失。研究表明，与野生型菌株相比，ΔtssB-EP（突变株）表现出生物膜形成显著减少，同时半数致死剂量（LD₅₀）增加了2.7 log₁₀。此外，进行了一项疫苗接种试验，研究人员通过腹腔内（I.P.）注射亚致死剂量的ΔtssB-EP突变株免疫罗喉鱼（Labio rohita）幼鱼。在疫苗接种后35天（dpv），用野生型嗜鱼爱德华氏菌攻毒以评估对死亡率的保护。疫苗接种后，疫苗组抗体水平显著高于对照组（磷酸盐缓冲液（PBS）/模拟接种组）。在接种ΔtssB-EP突变株的罗喉鱼幼鱼组中观察到相对存活率（RPS = 70.83%）提高。结论：结果确认了ΔtssB-EP突变株毒力的显著减毒，该突变株引发了强烈的免疫应答，并为罗喉鱼（Labeo rohita）感染嗜鱼爱德华氏菌导致的死亡率提供了实质性保护。

**研究背景与问题**
水产养殖业中，传染病（特别是由嗜鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）引起的爱德华氏菌病）导致高发病率和死亡率，造成显著经济损失。疫苗接种是防控该疾病的最有效策略，但现有疫苗面临成本、安全性和实用性等挑战。抗生素的滥用加剧了耐药性细菌的传播，因此亟需开发替代控制措施，如合理设计的疫苗。VI型分泌系统（T6SS）是嗜鱼爱德华氏菌的关键毒力相关分泌机制，参与细菌黏附、胞内持久性、宿主定植和免疫调节。TssB（EvpB）是T6SS收缩鞘复合物的核心结构蛋白，其缺失可能削弱细菌毒力，同时保留免疫原性，成为活减毒疫苗开发的理想靶点。本研究旨在通过精准缺失tssB基因构建活减毒突变株ΔtssB-EP，并评估其在罗喉鱼（Labeo rohita）中的安全性和保护效力，为水产养殖提供新型疫苗候选。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

**研究方法与技术**
研究人员采用双步等位交换策略，利用自杀性质粒pTL1010（含阿拉伯糖诱导的反向选择系统）介导同源重组，从野生型嗜鱼爱德华氏菌（菌株WSFC2，来源：挪威生命科学大学）中构建了ΔtssB-EP突变株。主要技术包括：1）重叠延伸PCR融合tssB基因上下游同源臂（约500 bp），构建缺失盒；2）通过双亲接合（供体菌为大肠杆菌S17-1 λpir）将重组质粒转入野生型菌株；3）基于L-阿拉伯糖的反向选择筛选双交换重组体，并通过菌落PCR和Sanger测序确认精准缺失（约506 bp缺失）。样本队列为来自商业鱼场的罗喉鱼幼鱼（平均体重11 ± 0.5 g），无既往疾病史。

**研究结果**
- **同源重组与突变株构建（Homologous recombination and construction of the mutant）**：通过等位交换成功构建ΔtssB-EP突变株，PCR和Sanger测序证实tssB基因被精准框内缺失，而上下游基因tssA和tssC保持完整。
- **tssB基因部分缺失确认（Confirmation of partial deletion of the tssB gene）**：野生型菌株PCR产物（含tssB）大小为1615 bp，突变株产物（仅含上下游区域）为1109 bp，差异约506 bp；物种特异性PCR（靶向etfD基因）确认突变株仍为嗜鱼爱德华氏菌。
- **生物膜形成（Biofilm formation）**：结晶紫染色法定量分析显示，与野生型菌株相比，ΔtssB-EP突变株的生物膜形成能力显著降低（OD₅₇₀/OD₆₀₀比值下降，p < 0.001），表明生物膜相关表型受损。
- **突变株致病性（Pathogenicity of the mutant strain）**：通过腹腔注射不同剂量（10³-10⁹ CFU/鱼）测定半数致死剂量（LD₅₀），ΔtssB-EP的LD₅₀为1.0 × 10⁸ CFU/鱼，较野生型菌株（1.3 × 10⁵ CFU/鱼）增加约770倍（2.7 log₁₀），表明毒力显著减毒；累积死亡率呈剂量依赖性，死亡主要发生在攻毒后前3天。
- **血清IgM水平（Serum IgM）**：ELISA检测显示，疫苗接种后第3周（21 dpv）总血清IgM水平达到峰值，第4周仍维持高水平，显著高于模拟接种对照组（PBS组）（p < 0.05至p < 0.001），证明ΔtssB-EP能诱导明显的体液免疫应答。
- **相对存活率（Relative percentage survival）**：疫苗接种后35天，用野生型嗜鱼爱德华氏菌（1 × 10⁸ CFU/鱼）腹腔攻毒，Kaplan-Meier生存分析显示，疫苗组累积死亡率仅30%，显著低于对照组（p < 0.001），相对存活率（RPS）达70.83%；攻毒后未观察到疫苗接种相关死亡，细菌重分离确认死亡由野生型菌株引起。

**讨论与结论**
研究人员在讨论中强调，tssB缺失导致T6SS功能破坏，从而降低毒力，同时保留免疫原性，使ΔtssB-EP成为安全且有效的活减毒疫苗候选。减毒机制涉及生物膜形成减少（支持表型减毒）、LD₅₀大幅升高及残留毒力在可接受范围内（最高剂量仍有致死性，但免疫剂量10⁴ CFU/鱼无死亡）。框内缺失（约506 bp）降低了毒力回复风险，但需后续通过连续传代和全基因组测序验证遗传稳定性。免疫应答以总IgM升高为标志，但需进一步开发抗原特异性ELISA确认抗体特异性。保护试验证明系统性免疫保护有效，但攻毒途径（腹腔注射）不能完全模拟自然感染（黏膜途径），需在自然感染条件下评估。研究结论翻译如下：
“本研究证明，通过等位交换缺失tssB可产生遗传性明确的嗜鱼爱德华氏菌减毒株，该菌株毒力显著降低、生物膜形成减少、可检测的体液免疫激活，并对野生型攻毒提供显著保护。除获得的RPS值外，证明靶向T6SS核心结构成分可将病原体转变为低毒力状态同时保留疫苗潜力，这一发现具有重要意义。因此，ΔtssB-EP突变株应被视为有前景的概念验证候选株。其进一步开发需要开展互补实验、遗传稳定性测试、传代后安全性评估、抗原特异性免疫分析以及在更自然感染途径下的效力测试。”