脑脊液单细胞转录组学分析揭示结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎中免疫细胞异质性和多区室MIF/CD74相关通讯

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Single-cell transcriptomic profiling of cerebrospinal fluid reveals immune-cell heterogeneity and multicompartment MIF/CD74-related communication in tuberculous and purulent meningitis

　　

背景：结核性脑膜炎（TBM）是一种严重的中枢神经系统感染，宿主炎症失调导致神经损伤。TBM中脑脊液（CSF）免疫微环境的细胞组成，特别是与其他炎症性脑膜炎比较时，仍不完全明确。本研究利用单细胞转录组学表征TBM与化脓性脑膜炎（PM）中CSF免疫细胞异质性。方法：对5例TBM与5例PM患者治疗前CSF免疫细胞进行10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）。经过质量控制、环境RNA评估与双细胞过滤后保留96,594个细胞。利用经典谱系标记与簇特异性标记基因注释主要免疫细胞群及髓系、粒细胞亚群，并评估双细胞质控指标与环境RNA估计值。在适当时采用供体水平比较，评价免疫细胞组成、CD4+ T细胞转录状态、巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）/CD74表达、CellChat推断的通讯及计算机扰动谱。结果：鉴定出7类主要CSF免疫细胞群体，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、髓系细胞、粒细胞、B细胞、浆细胞与自然杀伤T（NKT）样细胞。免疫细胞组成在供体间差异显著。部分PM供体呈髓系或粒细胞富集，部分TBM供体CD4+ T细胞比例较高；组间差异为探索性且未持续达到统计显著。先天免疫区室再注释识别出广谱巨噬细胞样、单核细胞样、中性粒细胞样及CD1C+树突状细胞样群体。两个原定义髓系亚簇呈现协同T细胞相关转录程序，被解释为潜在误分类或技术混合细胞而非真实髓系状态。CD4+ T细胞占据连续转录景观，包含中央记忆（CM）样、细胞毒/衰老相关及活化效应记忆（EM）样状态，转录程序重叠。MIF广泛可检于各免疫区室，CD74在抗原提呈相关群体中最突出。CellChat在两组均识别MIF相关通讯，支持共享多区室炎症通讯程序而非TBM特异通路。探索性计算机扰动将MIF与CD74相关转录程序列为未来验证优先项。结论：本研究提供TBM与PM炎症CSF免疫微环境的供体感知单细胞转录组图谱，突出显著个体间异质性、广谱先天免疫模式、重叠CD4+ T细胞转录状态及多区室MIF/CD74相关通讯。这些转录组推断发现为假设生成性质，需在更大队列中以蛋白水平与功能学方法验证。

研究背景与立项依据

结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis, TBM）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）侵入中枢神经系统引起，尽管标准抗结核与辅助抗炎治疗，仍伴随高死亡率与长期神经后遗症。损伤不仅源于病原持续存在，也源于脑脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）、脑膜及血管周围免疫微环境中宿主炎症失调。既往抗结核免疫知识多来自外周血、肺组织与动物模型，对CSF这一受血脑屏障与血-CSF屏障限制的特殊区室中免疫细胞如何转录组织知之甚少。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）虽已用于中枢炎症疾病，但TBM相关研究仍存在关键空白：缺乏在更广炎症脑膜炎背景下的细胞景观解读、小队列中供体水平异质性易被池化分析高估、CD4⁺ T细胞状态多为重叠转录程序而非离散功能亚群、细胞间通讯网络尤其是巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor, MIF）/CD74轴是否TBM特异尚不明确。为此，研究人员以急性化脓性脑膜炎（Purulent meningitis, PM）为对照，对治疗前CSF免疫细胞进行scRNA-seq，旨在描绘炎症CSF免疫图谱并生成候选假说，而非直接鉴定TBM特异生物标志物。

主要技术方法概括

研究人员纳入中国人民解放军总医院第一医学中心神经内科收治的5例TBM与5例PM确诊患者，均于诊断腰穿、给药前采集新鲜CSF。细胞经低密度离心富集后行10x Genomics Chromium Next GEM 3′ v3.1建库与Illumina NovaSeq 6000测序。生信流程于R中完成：Cell Ranger比对GRCh38；Seurat（v4.2.2）做SCTransform归一化与聚类；Harmony按供体校正批次效应；SoupX与DecontX评估环境RNA；scDblFinder与DoubletFinder剔除双细胞；注释七大免疫群后，对髓系、粒细胞与CD4⁺ T细胞提取再聚类；AddModuleScore计算活化、细胞毒、耗竭、衰老、干扰素刺激基因（Interferon-stimulated gene, ISG）、Treg模块评分；CellChat（v1.6.1）推断配体-受体通讯；scTenifoldKnk做MIF/CD74虚拟敲除扰动；统计上以供体为单位行Wilcoxon秩和检验，细胞水平差异表达仅作探索可视化，伪 bulk 由DESeq2辅助敏感性分析。

研究结果

3.1 质量控制、整合与主要CSF免疫细胞图谱

经每样本质控、环境RNA校正与双细胞过滤保留96,594细胞，Harmony整合后UMAP解析出七大类：CD4⁺ T、CD8⁺ T、髓系、粒细胞、B、浆细胞、NKT样。供体水平堆叠条显示极强个体间变异；部分PM供体髓系/粒细胞富集，部分TBM供体CD4⁺ T偏高，但组间Wilcoxon检验未达显著（髓系PM略高、CD4⁺ T TBM非显著倾向高、粒细胞PM数值高但不显著，其余无差异）。结论：炎症CSF组成高度供体依赖，组间差异为探索性。

3.2 髓系与粒细胞再聚类揭示异质先天免疫状态

髓系分10亚簇、粒细胞分6亚簇。依C1QA/CD68、CD14/LYZ、CSF3R/FCGR3B、CD1C/FCER1A分别归为巨噬样、单核样、中性粒样、CD1C⁺ 树突状细胞样四类广谱身份。Myeloid_2与Myeloid_5共表达IL7R、TRAC、CD3D、GZMK等T细胞程序，结合双细胞分数与环境RNA估计，研究人员将其判为淋巴细胞误分类/污染或残留混合液滴，不视为真实髓系态。伪bulk分析示TBM髓系偏抗原提呈（HLA-DOB、CD1C、CLEC9A），PM偏炎症粒/髓系基因（S100A8、S100A12、AQP9），但粒系FDR<0.05基因极少。结论：先天区室呈供体可变谱，非疾病特异定态。

3.3 CD4⁺ T细胞再聚类识别广转录状态伴供体变异

CD4⁺ T再聚为CD4_C0–C5六簇，沿连续UMAP分布；依标记与模块分归中央记忆（CM）样、细胞毒/衰老相关、活化效应记忆（EM）样三态。模块评分示细胞毒/衰老态高KLRG1、GZMK、CX3CR1；活化EM态高CD69、HLA-DRA、ISG、PDCD1、FOXP3子集评分，但各程序跨态重叠。供体水平三态比例TBM vs PM无显著差异（P=0.31/0.84/0.55），UMAP按供体/疾病着色混杂。结论：CSF CD4⁺ T为连续景观而非互斥功能亚群，无TBM特异扩展。

3.4 MIF与CD74跨CSF免疫群及CD4⁺ T态表达

点图显示MIF广布于CD4⁺/CD8⁺ T、髓系、B、浆细胞、NKT样；CD74集中于髓系、B、浆细胞等抗原提呈群，CD4⁺ T中低且变。细胞毒/衰老态内CD74可检细胞保留T细胞标记但双细胞分数更高，故不判为功能CD74⁺ CD4⁺ T亚群。结论：MIF/CD74非CD4⁺ T限制，属多区室分布。

3.5 CellChat分析炎症CSF中MIF相关通讯

全局CellChat示MIF通路涉淋巴、髓系、B、浆、NKT样多群；TBM与PM均检获MIF通讯，信息流（information flow）TBM未高于PM，通路级比较未显示TBM选择性富集。MIF-CD74被选中是因表达分布连贯而非最高秩。结论：MIF/CD74相关通讯是共享多细胞炎症程序，非TBM特异或CD4⁺ T受限。

3.6 MIF与CD74在CSF免疫细胞中的探索性计算机扰动

scTenifoldKnk虚拟敲除MIF（于CD4⁺ T）预测调控距离变化基因含GZMA、CXCR6、IL7R、NR3C2，GO富集成淋巴细胞活化、细胞黏附调节、杀伤等；虚拟敲除CD74（于髓系）变化基因含GBP5、TNFSF10、SOCS1、IFITM1，GO富集II型干扰素应答与T细胞分化调节。结论：仅为计算优先排序，非因果/蛋白证据。

讨论与结论翻译

讨论指出，PM急性细菌相佐以粒/髓系招募，TBM亚急性/慢性伴持久抗原刺激与血管病变，本数据供体水平见PM髓系偏高、TBM CD4⁺ T非显著倾向高，契合两病生物学但未获显著组差，强调小队列须供体水平分析。CD4⁺ T连续态、颗粒酶/抑制受体单独转录不等于真实耗竭或细胞毒功能。MIF/CD74跨区室分布与CellChat结果共撑“共享多细胞炎症通讯”解读；CD74在CD4⁺ T可检但双细胞信号高须慎判。计算机扰动与I型/II型干扰素信号仅描述性，不判保护或致病。临床层面，当前TBM治疗仍倚抗结核+辅助地塞米松（HIV阴性生存获益、HIV阳性无同效）或阿司匹林信号，本图谱未提供靶向直接证据，MIF/CD74定为靶点需蛋白、功能、安全验证。局限含样本小、年龄/CSF炎症参数不匹配、PM异质、scRNA仅转录层、CellChat与扰动为非机制证明、Myeloid_2/5跨系转录难断误分类vs环境RNA、缺流式/空间/功能独立验证。

结论（译）：本研究提供TBM与PM中炎症CSF免疫微环境的供体感知单细胞转录组图谱。发现凸显显著个体间异质性、广谱先天免疫模式、重叠CD4⁺ T细胞转录状态及多区室MIF/CD74相关通讯。这些转录组推断发现具假设生成性质，须在更大队列以蛋白水平与功能学方法验证。