《Frontiers in Medicine》：Single-cell mapping of diabetic foot ulcers: mechanistic axes and therapeutic targets
编辑推荐：
糖尿病足溃疡（DFU）是一种异质性慢性伤口，其中炎症、修复和重塑的有序序列被持续不愈合所取代。尽管批量转录组谱分析和组织病理学揭示了炎症失衡和蛋白酶失调，但它们无法解析维持慢性性或定义残余修复能力的细胞状态、细胞间通讯和空间微环境。最近的单细胞和空间研究正在将
糖尿病足溃疡（DFU）是一种异质性慢性伤口，其中炎症、修复和重塑的有序序列被持续不愈合所取代。尽管批量转录组谱分析和组织病理学揭示了炎症失衡和蛋白酶失调，但它们无法解析维持慢性性或定义残余修复能力的细胞状态、细胞间通讯和空间微环境。最近的单细胞和空间研究正在将DFU重新定义为一种动态细胞生态系统，包含具有不同状态和转换的上皮、基质、免疫、血管和附属器细胞群。本综述综合了这些新兴数据集，并提出一个机制框架，其中DFU慢性性由四个相互关联的领域驱动：表皮阻滞，其特征为应激适应的基底角质形成细胞未能完成激活到分化程序；免疫-基质锁定，由趋化因子介导的白细胞募集、蛋白酶偏倚的基质转换和炎症消退缺陷维持；血管功能障碍伴神经血管解耦，表现为内皮应激、血管生成受损、低灌注、缺氧以及神经血管和汗腺相关稳态支持的丧失；以及增殖阻滞伴衰老负担，其中持续的p21相关细胞周期阻滞和衰老细胞积累限制了再生能力，同时放大了炎症和蛋白水解信号。总之，这些细胞和空间特征为DFU不愈合提供了统一解释，并突出了将描述性图谱转化为可操作干预所需的候选生物标志物、治疗机会和转化优先事项。
1 引言
糖尿病足溃疡（DFU）是慢性伤口，其中从炎症到修复的转变被破坏。其特征为持续炎症、蛋白酶活性升高、细胞外基质（ECM）重塑受损、灌注减少和再生能力降低。DFU不愈合并非统一的生物学状态，不同溃疡在神经病变负担、缺血性损伤、微生物生态、深度、生物力学负荷、肾病和系统性炎症方面存在差异。单细胞和空间方法使DFU生物学更具机制可解析性，但本身不建立因果关系。本综述聚焦于人类皮肤和伤口数据集，核心证据来自单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞核RNA测序和空间转录组学研究。不同数据集的技术差异在解释细胞状态定义一致性时被考虑。DFU不愈合围绕四个耦合轴组织：（1）表皮阻滞，（2）免疫-基质锁定，（3）神经血管-汗腺衰竭，（4）增殖阻滞和衰老负担。
2 单细胞定义的DFU不愈合轴
2.1 轴I——表皮阻滞
表皮失败源于角质形成细胞功能破坏和再生进展受损。急性伤口中基底角质形成细胞从静止过渡到增殖和分化，但在DFU中此过程被阻滞。
2.1.1 失调的角质形成细胞状态和停滞的分化
单细胞研究表明表皮失败反映了角质形成细胞状态组成改变和再生进展中断，而非细胞丰度减少。DFU边缘细胞丰富但功能失调：角质形成细胞呈现损伤反应特征但采用失调状态，阻碍分化和屏障恢复。Liu等（7）分析正常皮肤、急性伤口边缘和DFU边缘，发现DFU基底细胞2（BC-2）富含细胞因子反应和凋亡相关程序，糖尿病相关角质形成细胞（DAK）状态与凋亡调节和细胞葡萄糖稳态相关，同时分化角质形成细胞区室减少和KRT10表达降低，表明角质形成细胞状态进展和表皮成熟受损。角质形成细胞状态组成与临床结局相关：分化角质形成细胞状态富集与愈合相关。
2.1.2 失调的表皮-真皮信号阻断分化
病理性的真皮微环境对表皮造成再生阻滞。持续炎症细胞因子、过度ECM降解和代谢应激共同抑制再上皮化。Liu等（7）识别出DFU中CCL2+CXCL2+成纤维细胞和VWA1+血管内皮细胞增加，CellChat分析预测了从这些细胞以及IL1B+巨噬细胞和GZMA+CD8+ T细胞向BC-2和DAK的通讯，候选信号轴包括IL1B–IL1R2、TNF–TNFRSF1A等。Theocharidis等（4）识别出愈合相关成纤维细胞状态，富含ECM重塑因子和炎症介质，空间上这些成纤维细胞优先定位于伤口床而非再上皮化边缘。Choi等（6）在清创的人类DFU组织中验证了愈合相关成纤维细胞程序。高糖通过表观遗传和生化机制将瞬时炎症和缺氧输入转化为持久角质形成细胞阻滞。
2.1.3 表皮谱系进展中的阻滞陷阱分化
轨迹推断将DFU主要缺陷定位至早期谱系进展的阻滞。Liu等（7）应用伪时间轨迹重建显示DFU轨迹在应激和糖尿病相关基底状态中病理性积累。纵向分析进一步将这一分叉点定位至炎症向增殖早期转变的失败。在DFU中，角质形成细胞失去内在谱系可塑性，陷入自我强化的炎症基底状态。
2.1.4 靶向炎症以恢复角质形成细胞再生
轴I导向疗法可被视为支持角质形成细胞谱系进展的方法。两个互补方向包括：（1）时空限制性调节受体-配体信号以减少上游炎症输入；（2）表观遗传或表观转录组调节以减轻高血糖相关分子记忆并支持迁移和分化能力恢复。Tan等（23）在Leprdb/db伤口中融合IL-1Ra与ECM结合肽，延长局部IL-1R1阻断，加速再上皮化。Cao等（24）在人类TNF敲入db/db小鼠模型中显示不同TNF抑制剂对伤口愈合效果不同。表观遗传调节方面，Yang等（14）抑制DNA去甲基化和组蛋白H3甲基化可挽救糖尿病再上皮化。Dong等（15）揭示m6A去甲基化酶FTO作为葡萄糖敏感调节器，恢复FTO-TRIB3轴加速糖尿病伤口闭合。
2.2 轴II——免疫-基质陷阱
DFU中持续不愈合部分由联合免疫激活和基质功能障碍驱动。
2.2.1 免疫和成纤维细胞异质性
单细胞分析区分了DFU炎症为不同免疫激活状态和成纤维细胞亚群。Gan等（29）识别出人类DFU肉芽组织中两种单核细胞群体：CD14+CCL2+ Mono1和FCN1+CCR2+ Mono2，以及增加的CD8+GZMK+效应T细胞和减少的调节性T细胞。Theocharidis等（4）在愈合DFU中观察到IL1B/S100A8/S100A9高炎症髓系状态富集，非愈合DFU中C1QA/B/C高巨噬细胞和NKG7/GNLY高细胞毒性群体更多。Wong等（30）显示糖尿病上调肽基精氨酸脱亚氨酶4（PAD4），使中性粒细胞转向中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成。基质分析显示愈合DFU中愈合相关成纤维细胞亚群表达炎症和基质重塑基因，非愈合DFU中CCL2+CXCL2+成纤维细胞和GZMA+CD8+ T细胞扩张。
2.2.2 趋化因子募集和ECM降解
趋化因子驱动的白细胞募集和蛋白酶介导的ECM降解维持慢性炎症微环境。Theocharidis等（4）使用NicheNet分析预测愈合相关成纤维细胞与受体亚群之间的配体-靶点关系。Gan等（29）识别出互补的CCL2和CCR2表达髓系群体。蛋白酶失调方面，Liu等（31）报告非愈合溃疡伤口液中MMP-9/TIMP-1比值升高，TGF-β1降低。Wong等（30）显示糖尿病中性粒细胞经PAD4依赖的NETosis放大蛋白水解。ECM片段进一步增加炎症输入。
2.2.3 炎症向重塑转变失败
人类研究一致将炎症消退失败与修复性基质程序丧失联系起来。Theocharidis等（4）推断愈合DFU中成纤维细胞、愈合相关成纤维细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞状态间连接更强，而非愈合DFU中轨迹更分离。Gan等（29）观察到炎症单核细胞群体扩张伴随COL6A1+COL6A3+和COL7A1+COL10A1+成纤维细胞丢失。干扰研究提供方向性信息：糖尿病巨噬细胞抑制成纤维细胞修复程序，而成纤维细胞来源的CCL2在急性伤口中贡献于生理性髓系募集。
2.2.4 打破免疫-基质炎症循环
轴II治疗应匹配当前伤口中主导的可逆过程：过度募集和蛋白酶损伤需控制破坏性髓系活性；消退或胞葬失败需促消退重编程；成纤维细胞修复受损或基质不稳定需恢复修复容许的基质环境。Cunnion等（36）检测到C5a和C3片段升高，经典补体通路抑制减少白细胞浸润。Sawaya等（37）发现TREM1-FOXM1信号减弱，局部TREM1激活增加FOXM1+中性粒细胞募集并减少NET形成。消退素D1（Resolvin D1）加速db/db小鼠伤口闭合。Maschalidi等（39）通过SLC7A11抑制增加胞葬作用。基质导向治疗方面，胶原/氧化再生纤维素敷料在随机试验中闭合率数值更高但未达统计学意义，而蔗糖八硫酸酯敷料在神经缺血性DFU中增加20周闭合率。
2.3 轴III——血管功能障碍和神经血管解耦
微血管功能障碍以炎症和应激相关内皮状态为特征，血管生成能力降低，导致低灌注、持续缺氧和组织支持受损。
2.3.1 内皮应激状态和血管生成受损
Zhao等（44）在计算再分析中将人类DFU内皮细胞异质性解析为11个亚群，非愈合溃疡富集EC-5（急性炎症程序），愈合相关EC-8耦合应激适应与代谢重编程。Zhang等（45）识别出ENTPD1+内皮状态富集于愈合样本，与嘌呤代谢和ACKR1–MIF信号减少相关。
2.3.2 缺氧相关神经血管和汗腺功能障碍
Guo等（46）观察到人类DFU中形态学保留的汗腺但ATP1A1表达降低，腺周CD31阳性血管和III类β-微管蛋白阳性神经信号减少。高血糖损害HIF-1α稳定化和缺氧反应性血管生成信号。Luo等（48）发现2型糖尿病患者汗腺神经支配减少，与糖化血红蛋白相关。CellPhoneDB分析预测正常皮肤中神经、内皮和汗腺细胞间的候选配体-受体相互作用。
2.3.3 受限的内皮可塑性和慢性神经血管重塑
Lu等（49）报告非愈合DFU中CCND1、ENO1、HIF-1α和SERPINE1下调，轨迹推断内皮状态转换受限。Guo等（46）在db/db足模型中显示18周糖尿病小鼠比6周小鼠更严重的汗腺功能障碍、低灌注和腺周神经血管异常。Sugiyama等（50）报告汗腺周围IV型胶原基底膜增厚。Galkowska等（51）检测到DFU组织中生长相关蛋白43表达，但神经纤维未恢复。
2.3.4 恢复神经血管功能和保护微环境
轴III治疗需区分临床基础管理、情境特异性辅助和新机制导向策略。氧疗作为情境依赖性辅助：高压氧和循环局部氧在随机试验中显示效果。血管评估和血运重建解决动脉流入，残余神经源性微血管功能障碍需额外治疗。临床前研究识别内皮反应性为可逆约束：组织纳米转染介导的PLCγ2启动子去甲基化恢复VEGF反应性。整合素αvβ3激动剂FZ1增加内皮增殖和毛细血管样形成。协调的神经血管修复方面，含VEGF和BDNF模拟肽的可喷雾水凝胶增加血管和神经再生。汗腺导向修复可能改善局部汗腺功能和屏障维持，但需依赖充足灌注和可控炎症。
2.4 轴IV——衰老驱动的修复限制
DFU中持续阻滞相关状态、衰老相关分泌活性（SASP）和再生储备减少可能收敛以限制修复可塑性。
2.4.1 跨区室的增殖阻滞
单细胞分析识别出DFU细胞群体中增殖能力的结局相关差异，最清晰分离出现在基底角质形成细胞。MKI67表达在基底角质形成细胞中集中，愈合DFU中MKI67更高，非愈合DFU中FOS更高。CDKN1A/p21沿分化轨迹变化，与结局相关但因果贡献未解决。急性小鼠伤口研究识别出p21高基质和内皮群体，而糖尿病小鼠和人类外植体实验显示巨噬细胞向成纤维细胞传播阻滞相关特征。
2.4.2 衰老相关炎症和基质重塑
人类DFU伤口边缘活检显示CDKN1A升高、TP53降低，伴随IL1A、CXCL8、MMP10、SERPINE1等诱导。糖尿病巨噬细胞来源的CXCR2配体诱导成纤维细胞核p21，局部CXCR2拮抗改善糖尿病小鼠和人类外植体伤口修复。单细胞分析识别出伤口液巨噬细胞中共享的延迟愈合程序。SASP相关细胞因子和蛋白酶可能维持白细胞募集、基质降解、角质形成细胞应激和内皮不稳定性。然而，急性伤口中瞬时衰老成纤维细胞和内皮细胞通过PDGF-AA支持修复，其清除延迟愈合。
2.4.3 短寿命的再生支持
脂肪干细胞（ADSC）提供实验上可处理的再生支持来源，但糖尿病ADSC显示增殖和活力降低、抗氧化保护受损、线粒体功能障碍和分泌活性改变。晚期糖基化终末产物（AGEs）通过RAGE-p38信号快速降低ADSC活力。高糖暴露增加自噬和凋亡。糖尿病环境中过度的MMP活性可降解ECM组分和生长因子信号。
2.4.4 减少衰老和恢复再生信号
治疗决策需将病理状态标准转化为谱系分辨的原位靶点确认。候选衰老细胞需有慢性细胞周期阻滞、SASP或蛋白水解活性、大分子损伤、代谢重塑和凋亡抵抗的一致证据。局部、短程或微环境门控给药可减少全身暴露。MMP-3响应性纳维托克（navitoclax）纳米器件在体外增加衰老选择性。当衰老状态可逆或细胞身份不确定时，减少病理分泌或恢复功能较为保守。局部CXCR2拮抗减弱巨噬细胞到成纤维细胞的衰老相关信号。Tβ4工程化ADSC胞外囊泡微针贴片通过PTEN/PI3K/AKT信号减少衰老标志并改善糖尿病伤口修复。当再生储备已耗尽时，需补充再生支持，如Wharton胶间充质干细胞来源外泌体在随机试验中缩短DFU闭合时间。
3 轴引导的精准DFU治疗转化
3.1 分层和预后评分
多参数轴评分可能比单一生物标志物更具信息性。综合细胞状态组成、信号活性和跨区室耦合，轴评分可提供更生物学整合的复合指标。临床部署需阶段经验验证。二元“高/低”模式可作为可解释的初步近似，阈值来自结局注释队列。可行性得到其他疾病中高维研究的支持，如BayesPrism、CIBERSORTx等去卷积方法。
3.2 轴耦合的联合治疗
联合治疗应遵循轴耦合原则。阶段1优先缓解上游抑制性约束，联合处理轴II和轴III。阶段2在微环境容许后恢复细胞反应性。阶段3处理轴IV的再生耗竭，结合衰老治疗与再生补充。
3.3 试验：纵向单细胞/空间终点
将纵向单细胞和空间分析整合到DFU试验中，使评估从简单闭合转向机制信息性研究。三点采样策略：清创后基线、早期药效学读数和结局相关标本。关键空间指标包括从无序炎症聚集体到结构化肉芽组织的转变、神经血管重耦恢复和上皮屏障重建。单细胞端点集中于轴活动评分和组成变化。
4 讨论
单细胞和空间分析支持将DFU不愈合视为动态、空间异质性条件，由四个相互作用的机制轴维持。此框架超越细胞类型计数，识别可治疗的状态改变和转变失败。转化此多轴框架需要操作三元组：基于轴的分层、合理联合治疗和纵向机制读板。尽管纵向分子读板可区分早期靶点参与和机制无反应，但未建立因果方向。当前人类DFU图谱多为横断面和相关性。未来需结合标准采样、更高分辨率空间平台、原位验证和干扰实验。最终，将复杂图谱转化为标准化、可检测的检测面板，以指导初始模式选择和适应性治疗排序。
