单细胞和空间景观揭示幽门螺杆菌相关胃癌中三级淋巴结构成熟受损

《Frontiers in Immunology》：Single-cell and spatial landscape reveals impaired tertiary lymphoid structure maturation in Helicobacter pylori–associated gastric cancer

　　

背景：三级淋巴结构（TLSs）是参与抗肿瘤免疫的关键免疫微环境。然而，其功能影响取决于肿瘤免疫微环境（TIME）内的空间定位、成熟状态和细胞组成。尽管幽门螺杆菌（H. pylori）在胃癌发生和免疫调节中的作用已得到认可，但其对胃癌中TLS结构和功能的影响仍知之甚少。方法：研究人员整合了公共单细胞RNA测序（scRNA-seq；HRA000704, GSE150290, 和 GSE249874；n=36）、空间转录组学（ST；GSE251950；n=9）和多重免疫荧光（mIF）染色（n=90），以全面分析H. pylori分层下的TLS。随后，采用Kaplan–Meier（KM）分析、限制性立方样条（RCS）分析、受试者工作特征（ROC）分析和一致性指数（C-index）评估，以确定不同TLS相关特征对临床结果的预测价值。结果：H. pylori阳性胃癌显示优先的肿瘤周围TLS定位和降低的TLS成熟。在TLS内，H. pylori阳性肿瘤显示HSP70⁺ B细胞积累和ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞减少。这种组成性转变与CD21⁺滤泡树突状细胞（FDC）网络和CD23⁺生发中心样结构的破坏相关。基于这些TLS内相互免疫模式，定义了两种TLS组成状态。TLS类型1，以HSP70⁺ B细胞富集和ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞减少为特征，在H. pylori阳性肿瘤中富集，而TLS类型2呈现相反模式，并与良好总生存期（OS）相关。将TLS组成纳入传统临床病理模型可将5年ROC曲线下面积（AUC）从0.847提高到0.910。结论：本研究识别了一种H. pylori相关的TLS组成状态，其特征为HSP70⁺ B细胞富集和ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞减少。将TLS组成纳入临床病理模型为胃癌提供了增量预后信息。

**论文解读**

**研究背景与问题**

胃癌（GC）是全球第五大常见恶性肿瘤，幽门螺杆菌（H. pylori）作为I类致癌物，是其主要感染性风险因素。慢性H. pylori感染不仅驱动胃黏膜慢性炎症，还促进免疫抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）形成，并与抗PD-1治疗的非应答率升高和免疫检查点抑制剂（ICI）疗效降低相关。三级淋巴结构（TLSs）是在病理条件下于非淋巴组织中形成的异位淋巴聚集体，其存在、密度、成熟状态及空间定位在多种癌症中与抗肿瘤免疫和患者生存密切相关。然而，在胃癌中，TLS的抗肿瘤功能不仅取决于其数量，还受其空间位置（肿瘤内 vs. 肿瘤周围）、成熟状态（是否含生发中心）及内部细胞组成的影响。尽管已知H. pylori感染可在非肿瘤胃黏膜中诱导淋巴滤泡形成，但在胃癌中，H. pylori感染是否重塑TLS的细胞组成、空间组织和成熟状态，以及这些改变是否具有临床意义，尚不清楚。因此，本研究旨在系统解析H. pylori感染对胃癌TLS异质性的影响。

**研究内容与结论**

研究人员整合了公共单细胞RNA测序（scRNA-seq；来自HRA000704、GSE150290和GSE249874数据集，共36例胃癌患者，其中25例H. pylori阳性、11例阴性）、空间转录组学（ST；GSE251950，9例原发性胃癌组织）和多重免疫荧光（mIF）染色（90例胃癌患者，来自安徽理工大学第一附属医院）数据，联合TIDE算法分析、TCGA-STAD和PRJEB25780免疫治疗队列验证，全面解析了H. pylori分层下胃癌TLS的免疫细胞组成、空间分布及临床预后关联。研究发现：H. pylori阳性胃癌呈现肿瘤周围TLS（pTLS）优先定位和TLS成熟度降低；在TLS内部，H. pylori阳性肿瘤中HSP70⁺ B细胞富集而ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞减少，伴随CD21⁺滤泡树突状细胞（FDC）网络和CD23⁺生发中心样结构破坏。基于此，定义了两种TLS组成状态：TLS类型1（HSP70⁺ B细胞高、ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞低）富集于H. pylori阳性肿瘤，与不良预后相关；TLS类型2（相反模式）与良好总生存期（OS）相关。将TLS组成评分纳入传统临床病理模型（包括病理分期和淋巴结侵犯）后，模型3年和5年时间依赖性ROC曲线下面积（AUC）显著提高，C-index增加，提示TLS组成提供了超越TLS数量的增量预后价值。该研究揭示了H. pylori相关胃癌中TLS的免疫重塑特征，为预后分层和免疫治疗策略提供了初步见解，论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要技术方法**

研究人员整合了来自三个公共数据集（HRA000704、GSE150290、GSE249874）的36例胃癌患者（25例H. pylori阳性，11例阴性）的scRNA-seq数据，以及来自GSE251950的9例原发性胃癌的ST数据，并纳入90例胃癌患者（安徽理工大学第一附属医院）的mIF染色队列。主要方法包括：scRNA-seq用于识别感染相关的免疫细胞亚群；ST用于评估TLS富集区域中关键细胞亚群的分布；mIF用于验证TLS内细胞定位、滤泡结构及成熟标记。此外，还使用了TIDE算法、TCGA-STAD和PRJEB25780免疫治疗队列数据进行生存分析和免疫治疗反应预测。

**研究结果**

1. **H. pylori阳性胃癌中TLS空间分布改变和成熟度降低**：通过H&E和免疫组化（IHC）分析90例胃癌组织，发现H. pylori阳性（HP_P）患者中肿瘤周围TLS（pTLS）比例和密度显著高于H. pylori阴性（HP_N）患者，而HP_N患者中肿瘤内TLS（iTLS）密度和成熟TLS密度更高。KM分析显示，在HP_N患者中，高iTLS密度、高pTLS密度和高成熟TLS密度均与良好OS相关；而在HP_P患者中，仅iTLS密度具有预后保护作用，pTLS密度无显著预后价值。

2. **H. pylori分层胃癌的scRNA-seq图谱**：整合scRNA-seq数据得到197,812个高质量细胞，分为6个主要谱系。HP_P肿瘤中B/浆细胞比例显著升高，T/NK细胞比例显著降低，mIF染色进一步验证了该模式。

3. **HP_P胃癌中ZNF683⁺ CD8⁺效应记忆T细胞显著减少**：T/NK细胞亚群分析识别出13个转录不同亚群。HP_P肿瘤中CD4T_C1_SELL（初始CD4⁺ T细胞）选择性扩增，而CD8T_C2_ZNF683（效应记忆）、CD8T_C4_PDCD1（耗竭）和CD8T_C6_SLC4A10（MAIT样）CD8⁺ T细胞亚群显著减少。

4. **HP_P胃癌以HSP70⁺ B细胞增加为特征，与不良预后相关**：B细胞亚群分析识别出9个亚群，其中HSP70⁺ B细胞在HP_P肿瘤中特异性扩增，mIF染色证实其密度升高。伪时间分析显示HSP70⁺ B细胞更倾向于沿滤泡外分化路径。KM分析显示高HSP70⁺ B细胞密度患者OS显著缩短。

5. **TLS内细胞组成与预测的免疫治疗相关特征关联**：TIDE分析显示HP_N患者预测免疫治疗应答率显著高于HP_P患者（66% vs. 22%）。在PRJEB25780免疫治疗队列中，应答者富含ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞等效应细胞特征，而HSP70⁺ B细胞特征有限。ST分析显示TLS-high区域同时富集ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞和HSP70⁺ B细胞特征，但mIF进一步证实HP_P肿瘤TLS内HSP70⁺ B细胞比例更高，HP_N肿瘤TLS内ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞比例更高。

6. **ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞减少和HSP70⁺ B细胞扩增表征HP_P胃癌中不成熟TLS组成状态**：scRNA-seq和mIF均显示HSP70⁺ B细胞与ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞呈负相关。HP_N肿瘤呈现有序的CD20⁺ B细胞滤泡、连续CD21⁺ FDC网络和CD23⁺生发中心样结构，而HP_P肿瘤显示FDC网络碎片化和生发中心样结构受损。ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞密度与CD21⁺和CD23⁺信号正相关，HSP70⁺ B细胞密度与两者负相关。

7. **TLS组成改善HP_P胃癌的预后分层**：基于TLS内HSP70⁺ B细胞和ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞密度，通过K-means无监督聚类将TLS分为两种功能亚型：TLS类型1（HSP70⁺ B细胞高、ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞低）和TLS类型2（相反）。多变量Cox回归显示TLS组成评分（log2[(TLS类型1+1)/(TLS类型2+1)]）是独立预后因素。HP_N肿瘤以TLS类型2为主，HP_P肿瘤以TLS类型1为主。TLS类型2优势型患者OS显著更好，且在II期比III期更常见。RCS分析显示死亡风险随TLS组成评分升高而增加。将TLS组成纳入临床模型后，C-index和3年/5年ROC AUC均显著提高，优于仅纳入TLS数量的模型。

**总结与结论**

研究人员发现，H. pylori阳性胃癌中TLS的免疫细胞组成发生广泛重塑，表现为HSP70⁺ B细胞富集、ZNF683⁺ CD8⁺ T细胞减少以及不成熟的淋巴组织结构。这些TLS组成状态与临床预后密切相关，且TLS组成评分能提供超越传统病理因素和TLS数量的增量预后信息。该研究强调了TLS质量和细胞组成在胃癌中的重要性，并为H. pylori阳性胃癌的免疫治疗策略提供了初步线索。研究结论翻译如下：本研究描述了与H. pylori相关的胃癌免疫改变，与T细胞和B细胞稳态改变及TLS重塑相关。它还识别了一种独特的TLS模式，可能作为预后分层的候选相关因子，并为H. pylori阳性胃癌的免疫治疗策略提供初步见解。