聚酯C-CP纤维柱上色谱参数及所得品质因数的重复性与再现性：用于HEK293来源细胞外囊泡的常规分离与分析

《Analytical Methods》：Repeatability and reproducibility of chromatographic parameters and resulting figures of merit on polyester C-CP fiber columns for the routine isolation and analysis of HEK293-derived extracellular vesiclesOpen Access

　　

近年来，人们对细胞外囊泡（EVs）的兴趣呈指数级增长，研究论文数量不断增加以及开发管线中基于EV的潜在治疗药物数量不断增多即为明证。然而，该领域当前的瓶颈仍然是对EVs进行常规和可规模化分离的高效且可重现方法的需求。本文证明了在疏水相互作用色谱模式下运行的聚酯毛细管通道聚合物（C-CP）纤维柱适用于细胞外囊泡的常规分析，以保留时间、峰面积和柱背压作为性能指标。研究人员在来自5个组装批次的10根分析柱上验证了运行间重复性（单柱）和纤维柱组装过程的一致性（柱间再现性）。重复性和再现性均表现出高度一致性，保留时间（<0.6% RSD）和峰面积（<4% RSD）的相对标准偏差较低。压力测量显示出较大的变异性，运行间重复性<7% RSD，柱间再现性<17% RSD。色谱谱图在所有五个批次中高度重现。先前制备的一根柱子（六个月）表现出与新制备柱子非常相似的性能，证实了柱子储存期间的稳定性。研究人员在两根柱子上进行了为期五天的方法稳健性验证，日间变异性为保留时间0.3% RSD，峰面积1.2% RSD。开发了一种四分钟的"快速"方法，用于分析条件筛选和细胞培养过程中EV水平的在线监测。最后，确定了澄清培养基的最佳进样体积：针对亚群分析的分离效率为4 μL，批量EV群体分离的最佳进样体积为12 μL。

论文解读：聚酯C-CP纤维柱用于HEK293来源细胞外囊泡常规分离分析的重复性与再现性评估

一、研究背景

近年来，细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）研究兴趣呈指数级增长，EVs作为具有诊断和治疗应用潜力的生物纳米颗粒受到广泛关注。然而，该领域当前的主要瓶颈在于缺乏高效且可重现的EV常规规模化分离方法。EVs可从血液、尿液、母乳、唾液、植物及细胞培养上清等多种来源获得，其中HEK293细胞系来源的EVs因样本基质相对受控而特别适用于治疗性EV制备。现有分离方法如超速离心、尺寸过滤、聚合物沉淀和免疫亲和捕获等普遍存在耗时、成本高、劳动强度大、产率低及共分离污染物等问题。尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）和切向流场流分离（tangential flow field-flow fractionation, T4F）虽应用广泛，但通量和分辨率有限。基于EV表面疏水性的疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC）模式为高效分离提供了新途径，但色谱柱性能的系统性重复性与再现性评估仍属空白。本研究旨在评估聚酯基毛细管通道