《Analyst》：Application of mass spectrometry techniques for analysis of higher order structure of proteinsOpen Access
确定蛋白质和蛋白质复合物的高级结构（HOS）对于理解其功能、动力学和相互作用至关重要。传统的结构生物学方法，如X射线晶体学和核磁共振，能够提供高分辨率快照，但通常需要大量均质样品，且可能遗漏动态或异质状态。质谱（MS）已成为在天然或近天然条件下对完整蛋白质和组装体进行灵敏、快速分析不可或缺的工具。本综述讨论了基于质谱的主要HOS探测策略。天然质谱（nMS）保留非共价相互作用，并表现出反映折叠状态的特征电荷态分布，而天然自上而下碎裂和离子迁移谱提供序列特异性和构象特异性信息。氢-氘交换质谱（HDX-MS）测量骨架酰胺交换速率，以绘制溶液中溶剂可及性、配体结合和变构调节的区域。共价标记质谱不可逆地修饰溶剂可及侧链，实现表位作图和检测细微构象变化，而蛋白质快速光化学氧化（FPOP）提供瞬态结构的微秒级快照。化学交联质谱（XL-MS）应用双功能试剂捕获残基或亚基之间的邻近性，为整合建模和蛋白质组-wide相互作用作图提供距离约束。研究人员概述了这些模式在仪器、软件、标记化学和细胞内技术方面的最新进展，并展示了其在表征膜蛋白、大型组装体、治疗性抗体、 intrinsically disordered proteins 和蛋白质-配体复合物中的应用。总之，这些工具为HOS提供了互补的见解，正在重塑结构生物学、生物制药开发和机制研究。
**Introduction**
蛋白质通过复杂的三维折叠和组装形成高级结构。传统高分辨技术如X射线晶体学、冷冻电镜（cryo-EM）和核磁共振（NMR）提供原子细节，但需要大量样品并可能受结晶等限制。质谱（MS）在过去四十年中从分子量测定工具发展为表征蛋白质结构和动态的多功能平台，具有高灵敏度、耐受异质性和样品量少等优势。
**Native mass spectrometry**
天然质谱（nMS）在电喷雾电离条件下保留非共价相互作用，使完整蛋白质、蛋白质-配体复合物和膜蛋白以接近天然的高级结构进入气相。电荷态分布（CSD）反映折叠状态，与离子迁移（IM）联用可测量碰撞截面，提供构象信息。
**Sample preparation and membrane proteins**
nMS常用挥发性盐如乙酸铵，但缓冲容量有限；烷基铵缓冲液和氟化乙胺等新缓冲液被探索。膜蛋白通常以去垢剂胶束、纳米盘或脂质体形式引入，需优化去垢剂和脂质条件以保持天然结构。
**Mutations and PTMs**
nMS通过监测CSD变化研究单氨基酸突变和翻译后修饰（PTMs）。例如，DJ-1突变体的构象稳定性差异、RhoA Y42C突变体的Mg
2+结合增强、磷酸化对Aur-A/Bora复合物组装的影响，以及通过天然毛细管电泳-nMS检测核小体组蛋白PTM串扰。
**Ion mobility-mass spectrometry**
离子迁移谱（IM-MS）依据电荷、大小和形状分离离子，可分析配体结合引起的构象变化。例如，p53与RITA结合后CSD向低电荷态移动，MDM2与Nutlin-3结合后构象群体收缩；膜蛋白如TRAAK的脂质结合受金属离子调节。
**Native top-down mass spectrometry**
天然自上而下质谱（nTDMS）对完整蛋白进行质量选择并碎裂，可鉴定蛋白形式、修饰位点和配体结合位点。常用碎裂方法包括碰撞诱导解离（CID）、电子转移/捕获解离（ETD/ECD）、表面诱导解离（SID）、紫外光解离（UVPD）等。多种开源软件如UniDec、TopPIC等支持数据分析。
**CID**
CID产生b/y型离子，可探测溶剂暴露区域；碰撞能量与蛋白解离程度相关，反映亚基间相互作用强度。CID在较低压力下通常产生高电荷单体，而SID更倾向于保留拓扑结构。
**ECD/ETD**
电子基碎裂方法产生c/z型离子，保留不稳定修饰和非共价相互作用。ECD可用于分析碰撞解折叠蛋白的区域，揭示结构可及性；膜蛋白的亚基相互作用和外部区域也可通过ECD研究。
**SID**
表面诱导解离通过高能表面碰撞快速沉积能量，产生与亚基拓扑相关的片段。例如，人20S蛋白酶体的SID产生α7和α7β7产物，符合已知环状结构。SID与电荷检测质谱（CDMS）联用可分析大型病毒衣壳。
**UVPD**
紫外光解离（193 nm或213 nm）产生丰富碎片，可表征蛋白形式、PTMs和构象。UVPD可断裂二硫键，提高序列覆盖率；通过碎片模式可区分蛋白稳定性，如四聚体血红蛋白的UVPD不产生二聚体产物，而链霉亲和素和转甲状腺素蛋白则产生。
**IRMPD**
红外多光子解离（IRMPD）作为低能量方法，可从天然膜中释放完整蛋白，并从核糖体亚基中释放核糖体蛋白，结合高分辨质谱揭示蛋白形式异质性。
**CIU**
碰撞诱导解离（CIU）通过在离子迁移前增加碰撞能量，产生展开指纹图谱，反映蛋白稳定性和配体结合。CIU已用于区分泛素链连接位点、抗体糖型差异、双特异性抗体的结构域稳定性，以及药物筛选。
**Charge detection mass spectrometry (CDMS) and allied technologies**
电荷检测质谱（CDMS）通过单离子测量直接测定电荷和质量，适用于大型异质体系如腺相关病毒衣壳和兆道尔顿复合物。两种商业实现为Waters CDMS和Thermo Direct Mass Technology（DMT）。
**Hydrogen–deuterium exchange mass spectrometry**
氢-氘交换质谱（HDX-MS）测量骨架酰胺氢与氘的交换速率，反映蛋白质的折叠、稳定性和动态。HDX遵循Linderstr?m-Lang模型，通常以EX2动力学为主，可计算保护因子；EX1动力学则反映协同构象转变。
**HDX approaches**
常见工作流程为自下而上：氘标记、淬灭、胃蛋白酶消化、低温LC分离和质谱检测。自上而下和完整蛋白HDX可减少回交换，并通过电子基碎裂限制气相 scrambling。实验设计包括连续标记和脉冲标记，用于比较分析或折叠路径研究。
**HDX for the characterization of protein–ligand and protein–protein interactions**
HDX-MS广泛用于表位作图，区分连续和不连续表位。多克隆抗体体系中，通过比较抗原与抗体复合物的氘摄取差异可识别主要表位区域。HDX-MS还可表征降解剂诱导的三元复合物、弱相互作用和膜蛋白构象状态。
**Monitoring allosteric effects**
HDX-MS可检测配体结合引起的远距离构象变化。例如，脂质结合导致大豆脂氧合酶催化域远端螺旋的交换增加；底物结合改变DXPS的构象动力学；hACE2结合触发SARS-CoV-2刺突蛋白的远距离动态变化。
**Detection of long-range allosteric changes**
通过比较不同状态的氘摄取模式，HDX-MS可定位直接结合位点之外的变构区域。例如，Grb2结合使PTP1B特定区域稳定，ATP结合使SecA稳定而SecY去稳定，表明变构调控。
**Probing local stability and allosteric conformational ensembles**
毫秒级HDX-MS可量化弱结构区域的局部稳定性，如糖原磷酸化酶的调节环。HDX-MS结合分子动力学模拟可绘制多结构域激酶LRRK2的构象图谱，揭示致病突变和抑制剂对构象平衡的影响。
**Allosteric regulation in membrane proteins**
在纳米盘中进行HDX-MS可检测跨膜螺旋的配体依赖性交换差异。例如，底物和抑制剂对木糖转运蛋白产生不同的HDX模式，血清素转运蛋白的不同抑制剂诱导不同交换模式，EAAT1的变构抑制机制得到验证。
**Allostery mediated by protein–protein interactions and macromolecular complexes**
HDX-MS揭示了蛋白质-蛋白质相互作用介导的变构效应。例如，Grb2与PTP1B结合增强酶活性，bortezomib结合ClpP稳定活性状态，SecA-SecYEG复合物中核苷酸驱动变构，以及受体结合触发病毒刺突蛋白的远距离变构。
**Mapping complex interactions**
HDX-MS用于绘制多结合体系中的相互作用界面。例如，两种单抗与白喉毒素的非重叠表位，治疗性抗体与TL1A的不连续表位，以及PI4KIIIβ-Rab11复合物的界面。HDX-MS还用于核糖体-新生链复合物和核蛋白复合物的研究。
**Covalent labeling mass spectrometry**
共价标记质谱（CL-MS）通过不可逆修饰溶剂可及侧链来研究HOS。选择性标记针对特定残基（如半胱氨酸的N-乙基马来酰亚胺），非选择性标记如DEPC和羟基自由基提供广泛足迹信息。
**DEPC**
DEPC修饰亲核残基（Cys, His, Lys, Thr, Tyr, Ser）和N端胺。DEPC CL-MS已用于研究PD-1与单抗结合时的构象变化、热应激下利妥昔单抗的结构改变、TNF-α的表位作图等。标记程度受溶剂可及性和微环境影响。
**FPOP**
快速光化学氧化（FPOP）通过激光光解过氧化氢产生羟基自由基，在微秒时间尺度上标记溶剂可及侧链。FPOP可氧化19种氨基酸，用于监测蛋白质折叠、聚集和表位作图。例如，用于表征Aβ1-42聚集中间体、贝伐珠单抗的热稳定性以及膜蛋白拓扑。
**FPOP with hydroxyl radicals**
羟基自由基FPOP已用于研究治疗性抗体稳定性、Aβ1-42聚集和表位作图。例如，IL-23与抗体结合后氧化减少的区域与表位一致；IL-6R与adnectin结合后溶剂可及性降低。FPOP还可用于膜蛋白如LH2的拓扑分析。
**In-cell FPOP**
细胞内FPOP（IC-FPOP）可在天然细胞环境中进行共价标记。自动化XY平台（AXYS）已用于HEK293细胞中的β-微管蛋白标记，检测到紫杉醇结合M-loop，表明IC-FPOP可探测细胞内蛋白质-药物相互作用。
**IDP applications**
CL-MS用于研究 intrinsically disordered proteins（IDPs）的构象动态。例如，亲水性标记Gly-Pro用于α-突触核蛋白，发现氧化形式C端标记增加，表明氧化减少C端紧凑性。DEPC CL-MS用于定位β2-微球蛋白与淀粉样抑制剂的结合位点。
**Membrane protein applications**
CL-MS可在细胞环境中研究膜蛋白。例如，维生素K环氧化物还原酶（hVKOR）的半胱氨酸用NEM标记，揭示华法林结合引起的构象变化。DEPC可标记跨膜结构域，提供拓扑约束。HL60细胞的羧基生物素化鉴定了多个跨膜蛋白。
**Chemical cross-linking mass spectrometry**
化学交联质谱（XL-MS）通过双功能试剂共价连接邻近残基，提供距离约束。交联剂种类包括胺反应性NHS酯、MS可裂解交联剂（如DSSO、DSBU）、亲和富集型（如PhoX）等。XL-MS适用于从纯化复合物到完整细胞的各种体系。
**Advancements in the chemistry of cross-linking mass spectrometry**
交联化学的进展包括可裂解交联剂简化鉴定、亲和标签富集提高灵敏度、FIX-MS稳定细胞内容物、点击化学连接等。定量交联策略如iQpIR可实现蛋白质组尺度的相互作用量化。
**Interpreting cross-links as restraints**
交联通常作为Cα-Cα距离的上限约束，可整合到分子对接（如HADDOCK）和整合建模平台（如IMP）中。结合冷冻电镜密度、分子动力学和深度学习预测，可提高模型准确性。例如，AlphaLink利用细胞内光交联数据改进AlphaFold2预测。
**Conceptual contributions of cross-linking mass spectrometry for higher order structure**
XL-MS提供稀疏但有力的空间约束，与cryo-EM结合可限制亚基排列；定量交联揭示条件依赖性构象变化；蛋白形式感知的交联可区分PTM状态；细胞内交联捕获天然环境中的瞬时相互作用；整合建模可量化构象群体。
**Summary**
质谱方法在近天然条件下分析蛋白质，提供动态、界面和高级结构信息。nMS、HDX-MS、CL-MS和XL-MS互补结合，可研究异质性、构象变化和相互作用。未来发展方向包括改进样品处理、天然分离和高性能仪器，将质谱进一步整合到结构生物学和药物开发中。
