混合营养培养下藻类多物种混合培养的物种动态与基因表达：户外中试规模北欧条件

《Biotechnology and Bioengineering》：Species Dynamics and Gene Expression in Algal Polycultures Under Mixotrophic Cultivation in Outdoor Pilot-Scale Nordic Conditions

　　

微藻多物种混合培养（microalgal polycultures）的混合营养培养（mixotrophic cultivation）与自养系统相比，可提高生物质生产力和废水中的营养盐回收。为了更好理解混合营养条件下非无菌多物种培养（non-axenic polycultures），本研究考察了在瑞典东南部户外跑道式池塘中春季和秋季培养的本地淡水绿藻多物种培养的物种组成和基因表达。培养物在渗滤液–KH₂PO₄培养基中自养条件下培养，或在添加葡萄糖或乳清渗透物的混合营养条件下培养。利用18S和16S rRNA基因的高通量测序分析群落组成，同时通过差异基因表达分析评估转录组响应。在自养条件下，真核群落保持稳定且以绿藻（Chlorophyta）为主，而混合营养培养促进了纤毛虫（Ciliophora）和轮虫（Rotifera）的增加。转录组分析显示，在混合营养条件下，光合作用相关基因下调，同时营养盐转运蛋白上调，这与营养盐去除增强一致。混合营养培养显示出增强碳水化合物积累的潜力，并上调了油酸和氨基酸（包括精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸和天冬酰胺）的生物合成途径。这些结果表明，混合营养条件同时驱动微生物群落转变和代谢重编程，强调了培养策略和多物种培养选择对于营养盐回收和生物产品生成等目标应用的重要性。

藻类培养是废水营养盐去除与回收的有效方法，可产生有价值的生物质，用于饲料、生物刺激素、生物塑料和生物燃料等。传统自养培养仅以光为能源，而混合营养培养（mixotrophic cultivation，一种同时利用光和有机碳作为能源的培养方式）利用有机碳作为额外能源，可提高生物质产量并延长低光低温季节的培养时间。然而，外部有机碳可能影响藻类光合作用、代谢产物谱以及与异养细菌的相互作用。多物种混合培养（polycultures，由多种微藻及伴生微生物组成的培养系统）相比单培养更稳健，但物种组成会因种间相互作用而改变，在户外开放系统中还面临废水杂质、天气变化和生物污染等挑战。目前，混合营养条件下多物种培养的基因表达研究有限，尤其是在实际户外中试规模条件下。因此，本研究旨在探究混合营养与自养模式下多物种培养的物种组成和基因表达变化，为优化户外大规模藻类培养提供依据。

研究人员在瑞典东南部户外跑道式池塘中，于春季和秋季培养本地淡水绿藻多物种培养，在自养（渗滤液–KH₂PO₄）和混合营养（添加葡萄糖或乳清渗透物）条件下运行。通过18S/16S rRNA基因高通量测序分析物种组成，通过mRNA测序进行差异基因表达分析。结果发现混合营养驱动真核群落向纤毛虫和轮虫增加的方向转变，细菌群落中变形菌和拟杆菌占优势；转录组显示光合作用下调、营养盐转运上调，碳水化合物积累增强，油酸和多种氨基酸合成途径上调。研究强调培养策略和多物种选择对营养盐回收和生物产品生产的重要性。论文发表在《Biotechnology and Bioengineering》。

主要技术方法包括：样本来源于2017年在瑞典卡尔马Moskogen垃圾填埋场曝气池收集的藻类联合体，在f/2培养基中培养；实验使用垃圾渗滤液（高N:P）和乳清渗透物（N:P=1），在户外1 m³池塘半连续运行，春季和秋季各8个循环。物种组成分析采用18S rRNA和16S rRNA基因扩增子高通量测序（Illumina MiSeq），经QIIME2等流程获得ASV并分类；基因表达分析采用真核mRNA测序，利用nf-core/metatdenovo注释，edgeR进行差异表达分析（q<0.05，|log₂FC|>1）。

### 3.1 物种组成动态

通过18S rRNA基因测序，发现接种培养物中绿藻门（Chlorophyta）占绝对优势（99.1%–99.9%），其中Desmodesmus armatus为优势种。自养处理（AT）中绿藻相对丰度稳定（89.7%–99.8%），而混合营养处理（Glu和WP）中绿藻波动较大（49.7%–97.6%），同时纤毛虫（Ciliophora）和轮虫（Rotifera）丰度增加（最高分别达47.2%和15.1%）。16S rRNA基因测序显示，混合营养处理中叶绿体序列比例降低，表明异养细菌丰度增加；细菌群落最终以变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主。这表明混合营养条件增强了生态位分化，但需警惕原生动物牧食风险。

### 3.2 基因表达谱

通过差异表达分析，在葡萄糖处理（Glu2）与自养处理（AT0-2）间鉴定出764个差异表达基因（DEGs），主要来自绿藻门（535个）。其中371个上调，393个下调。混合营养响应是瞬时的，葡萄糖添加后1小时未见显著变化，24小时后才激活，且葡萄糖消耗后恢复自养表达谱。

#### 3.2.1 光合作用

光合作用相关DEGs中90.6%在Glu中下调，包括光捕获复合体（LHC）、叶绿素合成酶等，表明混合营养抑制光合作用，与葡萄糖抑制CO₂固定一致。

#### 3.2.2 膜转运蛋白

Glu中硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白在绿藻和甲藻中高度上调（log₂FC=8–10），而磷酸盐协同转运蛋白下调，反映磷酸盐耗尽。ABC转运蛋白和透性酶上调，与营养盐去除增强一致。未观察到糖转运蛋白上调，可能因采样时葡萄糖已被消耗。

#### 3.2.3 碳水化合物代谢

所有已注释的碳水化合物代谢DEGs在Glu中上调，包括磷酸戊糖途径（PPP）的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）、糖酵解酶类、淀粉合成相关酶（葡聚糖磷酸化酶、1,4-α-葡聚糖分支酶）等，表明混合营养促进碳水化合物积累。此外，β-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶上调，提示可利用乳清渗透物生产这些商业酶。

#### 3.2.4 脂质代谢

脂质代谢中8个DEGs上调。绿藻中丙酮酸脱氢酶（PDH）和III类脂肪酶上调，前者促进脂肪酸合成，后者促进脂质降解，总体可能提高脂肪酸含量。脂肪酸脱饱和酶（FAD）上调，促进油酸合成。甲藻中生物素羧化酶、磷酸酰基转移酶和酰基转移酶上调，提示三酰甘油（TAG）合成增强。

#### 3.2.5 氨基酸代谢

大多数氨基酸生物合成DEGs来自绿藻，其中精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸和天冬酰胺合成途径上调，而赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸合成下调。碳氮水解酶高度上调（log₂FC=10.7），与有机氮去除增强一致。硅藻中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）上调，促进铵和碳酸氢盐同化。

#### 3.2.6 基因表达与物种和生化组成关联

尽管基因表达预示碳水化合物和脂质含量变化，但生化组成分析显示与自养相似，可能因混合营养活性波动和不同物种间相反调控所抵消。这强调了解多物种培养中特定物种代谢策略的重要性。

讨论部分指出，混合营养培养中微生物群落转变和代谢重编程对培养管理有重要影响，需根据目标（如色素生产、CO₂固定或代谢产物富集）选择合适的藻株/多物种和培养策略。基因表达数据揭示了混合营养的瞬时性和物种特异性，为优化户外培养提供分子标记。

研究结论：混合营养生产多物种培养是废水修复和提高藻类生物质产量的有前景方法。然而，在户外开放池塘系统中成功实施需要谨慎管理物种动态和污染风险。本研究表明混合营养模式下真核群落显著变化，纤毛虫和轮虫丰度增加，细菌贡献增加，变形菌和拟杆菌成为优势菌门。这些微生物变化以及混合营养模式下光合作用的下调，强调了根据预期结果选择合适藻株/多物种和培养策略的重要性。了解物种变化和基因表达响应有助于优化藻类培养策略，以提高生产力和目标代谢产物产量。与自养模式相比，混合营养藻类生物质含有更高水平的碳水化合物，并上调了油酸和精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、天冬酰胺等氨基酸的合成，凸显了其定向生物产品生成的潜力。此外，在不同环境条件（春季和秋季）下维持混合营养藻类培养的能力表明，这是一种灵活且具有韧性的方法，可延长培养季节。总之，根据环境和操作因素优化物种选择和培养模式可以显著提高藻类生物过程的效率和产出。