探索π-扩展香豆素荧光团基光可移除保护基团(PRPGs)的粘度敏感性用于精确光释放丙戊酸：检测与去纤维化TDP-43聚集

《Chemical Science》：Exploring viscosity sensitivity of π-extended coumarin fluorogen-based PRPGs for precise photorelease of valproic acid: detection and defibrillation of TDP-43 aggregationOpen Access

　　

蛋白质聚集导致的细胞微环境粘度改变，作为反映异常细胞行为的生物物理参数起着关键作用，可引发神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)等。在此，研究人员报道了一系列基于香豆素荧光团的光可移除保护基团(PRPGs，5a–d)的设计与开发，这些基团带有与π-扩展连接体相连的不同取代基，将粘度传感与可见光触发生物活性分子释放相结合。通过引入π-扩展共轭和系统取代，基于香豆素荧光团的PRPGs表现出基于扭曲分子内电荷转移(TICT)的荧光调制，以响应微环境粘度。结合理论计算，全面的光物理和光化学研究确定了PRPG 5d为最具粘度敏感性的系统，具有绿光吸收。在粘性条件下，受限的键旋转抑制了非辐射衰变和光异构化，从而实现了神经保护剂丙戊酸的有效光释放。PRPG 5d的通用性在生物相关的体外模型中得到证明，包括TDP-43蛋白聚集和帕金森病诱导的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。在细胞外和细胞内的神经退行性环境中，增加的粘度被有效感知，触发光介导的丙戊酸释放并随后去纤维化。总体而言，这项工作将基于香豆素荧光团的PRPGs确立为一种有前景的粘度引导、时空可控药物释放平台，为神经退行性疾病的诊断和靶向治疗提供了潜在应用。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
细胞微环境粘度作为生物物理参数，反映分子拥挤、代谢活性和结构组织变化，其异常升高与神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶变性(FTLD)）密切相关。蛋白质错误折叠或聚集（如TDP-43）导致细胞内流体流动受限，粘度上升，但精准感知这些微细变化并同步释放治疗药物仍是重大挑战。现有分子转子基荧光团(RBFs)利用扭曲分子内电荷转移(TICT)特性实现粘度传感，但缺乏整合光响应药物释放能力。光可移除保护基团(PRPGs)可实现高时空精度药物释放，但传统PRPGs常需紫外光或产生有害单线态氧。因此，开发兼具可见光吸收、粘度传感与可控释放功能的荧光团基PRPGs，对神经退行性疾病的诊断与治疗具有重要价值。该研究发表于《Chemical Science》。

**主要关键技术方法**
研究人员通过Heck偶联和N-甲基化反应合成了一系列香豆素荧光团基PRPGs（5a–d），系统改变π-扩展连接体端基取代基（吡啶、N,N-二甲基苯胺、苯并噻唑和苯并噻唑鎓）以调节电子给体-受体特性。采用稳态和时间分辨荧光光谱、圆二色光谱(CD)、透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征光学性质与蛋白聚集。理论计算使用M062X泛函和TZVP基集进行TD-DFT分析。体外模型包括TDP-43蛋白聚集（PBS缓冲液，pH 7.4）和MPP⁺诱导的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系（由印度理工学院Kharagpur的Dibyendu Samanta博士提供）。

**研究结果**

**光物理性质与粘度传感**
在乙腈中，PRPGs 5a–c吸收峰在437–458 nm，而5d因苯并噻唑鎓基团的强吸电子能力红移至560 nm，且HOMO-LUMO能隙降低。所有化合物均显示大斯托克斯位移（80–119 nm），表明TICT过程。在甲醇-甘油混合溶剂中，5b和5d的荧光强度随粘度增加增强4.4–4.7倍，而5a和5c减弱。通过乙二醇-甘油二元混合物（粘度16–870 cP）定量比较，5d的χ²值（3.8×10^?2）远高于5b（0.1×10^?2），显示5d对粘度更敏感。时间相关单光子计数(TCSPC)显示，5d在粘性介质中激发态寿命从0.54 ns增至1.31 ns，证实TICT态被抑制。温度依赖性实验（25–45°C）表明5d具有中等旋转能垒（E_a > k_bT），而5b的能垒更高（E_a ? k_bT），导致5b在非粘性介质中已保留较高荧光（量子产率0.14 vs 0.01），故5d更优。

**光释放丙戊酸及粘度效应**
5d在绿光（525±10 nm）照射下，通过¹H NMR和HRMS确认释放丙戊酸，光释放量子产率为0.11%。通过吸收光谱监测，在非粘性ACN/水（1:19）中，光异构化快速发生（30秒内吸收骤降），随后缓慢光解；而在粘性甲醇/甘油（1:9）中，仅观察到平缓吸收下降，表明键旋转受限使光解占主导。理论计算支持：在ACN/水中光异构化能垒为0.22 eV，在粘性介质中升至0.85 eV，从而抑制非辐射衰变，促进光释放。猝灭实验证实光化学通过单线激发态进行，质谱检测到甲氧基光产物，支持异裂离子对机制。

**体外TDP-43蛋白聚集传感与去纤维化**
将TDP-43蛋白在PBS中搅拌9天形成聚集，CD和TEM确认β-片层结构。加入5d后，荧光强度增强1.6倍，接近金标准硫黄素T(ThT)的1.8倍，而5a–c未见增强（因5b灵敏度低4倍）。分子对接显示5d结合于TDP-43的U形空腔。去纤维化实验中，5d与聚集TDP-43共孵育后用绿光照射不同时间，CD光谱从正信号（185 nm肩峰）恢复至负信号（186–188 nm），与游离丙戊酸处理组一致；TEM显示纤维平均长度从254.98 nm降至83.70 nm，Z-average值从222.4 d.nm降至32.35 d.nm，证实光释放丙戊酸有效去纤维化。

**细胞层面粘度传感与神经保护**
在SH-SY5Y细胞中，MPP⁺诱导帕金森病模型后，5d显示红色荧光增强，而正常细胞荧光微弱。共定位实验与ThT重叠，表明5d在细胞内识别粘度升高区域。MTT实验显示，5d在光照前IC₅₀ >100 μM，光照后正常细胞不变，MPP⁺处理细胞降至98.5 μM。进一步，100 μM MPP⁺与70 μM 5d共孵育后光照30分钟，细胞活力从74.4%升至75.1%（无显著变化），但相比单独MPP⁺组（活力更低），表明光释放丙戊酸抑制蛋白聚集，减轻神经毒性。

**结论总结**
研究开发了一系列基于香豆素荧光团的PRPGs（5a–d），以香豆素为核心、π-扩展共轭实现TICT-AIE机制粘度传感，并在光照下时空可控释放神经保护剂丙戊酸。系统取代基筛选表明，N-甲基苯并噻唑鎓取代的5d具有最高粘度敏感性和绿光激活能力。光化学研究揭示在粘性介质中键旋转受限促进光解，效率高于非粘性介质。体外TDP-43蛋白聚集和MPP⁺诱导细胞模型均证实，5d能有效感知升高的微环境粘度，增强荧光并触发丙戊酸释放，实现去纤维化和神经保护。该工作为神经退行性疾病的诊断与靶向治疗提供了多功能平台。