(+)-palitantin 的生物合成需要烷基水杨醛形成酶的同源物，且不涉及芳香族中间体

《Chemical Science》：Biosynthesis of (+)-palitantin requires homologs of alkyl salicylaldehyde-forming enzymes without involvement of an aromatic intermediateOpen Access

　　

(+)-Palitantin 是一种来源于 Penicillium palitans 的生物活性真菌聚酮化合物，具有一个高度官能团化的环己酮核心，含有多个立体中心。研究人员通过基因敲除实验以及关键步骤的体内和体外重构，阐明了其生物合成途径。Palitantin 中环己酮骨架的形成是由烷基水杨醛形成酶（alkyl salicylaldehyde-forming enzymes）的同源物催化的，且不涉及芳香族中间体。相比之下，已知的烷基水杨醛形成酶的产物是芳香族衍生物，包括非芳香族 trichoxide 途径中的产物。此外，cupin 蛋白（cupin protein）PaltE 增强了不稳定环己烯酮中间体的形成，以供 PaltF 进行立体特异性烯还原，并确保高效流向 (+)-palitantin。随后，SDR（短链脱氢酶/还原酶，short-chain dehydrogenase/reductase）PaltG 催化的醛还原和 P450 酶（cytochrome P450 enzyme）PaltD 催化的立体特异性羟基化完成了该途径，并在环己酮骨架上建立了立体化学复杂的修饰。研究人员的工作扩展了烷基水杨醛形成酶的功能范围，并为天然产物生物合成提供了一种高度程序化的策略。

环己酮衍生物是药物发现中的关键骨架，广泛存在于多种生物活性分子中。真菌聚酮 (+)-palitantin 于 1936 年首次从 Penicillium palitans 中分离，具有高度官能团化的环己酮核心和多个立体中心，对乙酰胆碱酯酶和蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 表现出抑制活性。尽管化学合成领域经过数十年努力，(+)-palitantin 高度取代的环己酮核心的立体控制构建仍是巨大挑战，其酶学组装逻辑尚未解析。早期同位素标记实验（²H、¹³C、¹⁸O 标记乙酸）提示其环己烷核心形成不涉及芳香族中间体，推测存在环己烯酮中间体并由烯还原酶催化，但该中间体及关键酶均未被鉴定。同时，基于已知烷基水杨醛途径（如 trichoxide 途径）的假设认为可能涉及芳香中间体，两者矛盾引发了研究兴趣。研究人员旨在阐明 (+)-palitantin 的生物合成途径并鉴定关键酶。

研究人员通过基因敲除、体内异源表达和体外酶学重构，鉴定了来自 P. palitans NRRL 2033 的 palt 基因簇，完整阐明了 (+)-palitantin 的生物合成途径。结论表明，该途径依赖烷基水杨醛形成酶同源物催化非芳香族环己烯酮骨架的构建，而非芳香族中间体；cupin 蛋白 PaltE 促进不稳定环己烯酮中间体的形成，与 PaltB 和 PaltF 协同作用确保高效通路流向；后续 SDR 酶 PaltG 和 P450 酶 PaltD 分别完成醛还原和立体特异性羟基化，最终生成 (+)-palitantin。该研究扩展了烷基水杨醛形成酶的功能范围，为天然产物生物合成中非芳香族骨架构建和立体化学控制提供了高度程序化的策略。论文发表在《Chemical Science》。

主要关键技术方法包括：① 基因敲除（利用 split-marker 策略在 P. palitans NRRL 2033 中分别敲除 paltA、paltI、paltC、paltB、paltE、paltF、paltG、paltD 等基因）；② 异源表达（在 Aspergillus nidulans LO8030 中表达 palt 基因簇及其组合，构建系列转化株）；③ 体外酶学反应（重组表达纯化 PaltB、PaltE、PaltF、PaltG、PaltD 蛋白，进行酶活测定及时间进程分析，辅以化学衍生化捕捉不稳定中间体）；④ 代谢产物分析（LC-MS 和 NMR 鉴定产物结构，包括新化合物 2–8、10、12、15、16）。样本来源为 P. palitans NRRL 2033 野生型菌株与 A. nidulans 异源表达宿主。

**Isolation and identification of (+)-palitantin and congeners**
从 P. palitans 14 天 PDB 培养物中分离得到 (+)-palitantin (1) 及六种相关代谢物 2–7。通过 NMR 和光谱分析鉴定 2–7 为新化合物（dehydropenihydrone A、B、penihydrone B、palitanol A、palitanol B），它们与 1 共享相同碳数和烷基化环己酮骨架，但取代基、氧化态和立体化学不同。

**Identification of the putative (+)-palitantin biosynthetic gene cluster**
对 P. palitans NRRL 2033 进行基因组测序，发现候选 palt 簇含 10 个基因。敲除 PKS 基因 paltA 和转录因子基因 paltI 完全消除了 1–7 的产生，证明其关键作用；敲除 BBE 样基因 paltJ 未影响代谢物谱，表明该基因不参与。

**Homologs of the alkyl salicylaldehyde-forming enzymes catalyze the formation of a cyclohexenone precursor for further modification**
在 A. nidulans 中表达 paltA、C、B、E 产生非芳香族产物 2、3、6、8，无芳香族代谢物。体外实验表明：PaltC 催化 9 的 C7 羟基氧化生成 6；PaltB 催化 6 中 3-OH 氧化成二酮醛 11，后者自发环化脱水为不稳定醛 10；PaltE 促进 11 向 10 的快速转化，且不介导脱水芳构化，与非芳香族途径一致。

**Coordinated PaltB, PaltE, and PaltF action directs productive flux toward (+)-palitantin**
敲除 paltF 导致 1、4、5 缺失，积累 2、3、6、7。体外实验以 10 为底物，PaltF 在 NADH/NADPH 存在下催化 10 的烯还原生成 12（C1–C6 双键还原）。一锅法联合反应显示，PaltB 和 PaltF 耦合可生成 12，加入 PaltE 显著提高 12 的早期形成和积累，表明三酶协同作用高效利用不稳定中间体 10，避免分流。

**PaltG-mediated aldehyde reduction supports main pathway progression**
重组 PaltG 催化 12 还原为 4（偏好 NADPH），敲除 paltG 导致产物大幅减少，仅检测到微量 1，提示宿主存在冗余酶。PaltG 还能还原 10 生成 2，证明其作为醛还原酶的灵活性。

**The P450 enzyme PaltD catalyzes a stereospecific C3 hydroxylation and completes the (+)-palitantin biosynthesis**
敲除 paltD 完全阻断 1 产生，积累 4 和 5（均无 C3 羟基）。在 A. nidulans 中过表达 paltD 并饲喂 4 可转化为 1，而 5 不被转化。体外微体实验证实 PaltD 特异性催化 4 的 C3 羟基化，对底物 C1/C6 反式构型有选择性。

**总结讨论部分**
研究人员全面解析了 (+)-palitantin 的生物合成途径，证明烷基水杨醛形成酶同源物可介导非芳香族路线。与已知途径不同，cupin 蛋白 PaltE 促进不稳定环己烯酮 10 的形成，而非脱水芳构化。PaltB、PaltE 和 PaltF 的协同作用确保 10 的高效生成和立体特异性烯还原，减少分流产物。SDR PaltG 和 P450 PaltD 相继完成醛还原和立体选择性羟基化，最终构建复杂环己酮骨架。该工作扩展了此类酶的功能范围，揭示了真菌聚酮生物合成中非芳香族骨架构建和立体化学控制的程序化策略。

**翻译研究结论部分**
总之，研究人员阐明了 (+)-palitantin 的完整生物合成途径，并证明烷基水杨醛形成酶的同源物可用于非芳香族生物合成路线。与先前表征的烷基水杨醛途径（其中相关环己烯酮中间体经历自发或 cupin 辅助脱水形成芳香族产物）不同，cupin 蛋白 PaltE 增强了不稳定环己烯酮 10 的形成，以供进一步的酶修饰。该中间体经过一系列确定的立体控制转化，组装成 (+)-palitantin 中立体化学复杂的环己酮骨架。体外重构表明，PaltB、PaltE 和 PaltF 的协同作用能够高效生成并进行 10 的立体特异性烯还原，从而最小化分流产物形成，并将通路流量导向 (+)-palitantin。随后，SDR PaltG 催化的醛还原和细胞色素 P450 酶 PaltD 催化的立体特异性羟基化完成了后期骨架修饰。这项工作扩展了烷基水杨醛形成酶的功能图景，突出了真菌聚酮生物合成中非芳香族骨架构建和立体化学控制的程序化策略。