紫花苜蓿黄酮类化合物的超声辅助双水相萃取优化及生长阶段、刈割频率和干燥方法对其组成和抗氧化能力的影响

《Journal of Agriculture and Food Research》：Optimization of Ultrasonic-Assisted Aqueous Two-Phase Extraction for Alfalfa Flavonoids and Effects of Growth Stage, Cutting Frequency and Drying Method on Their Composition and Antioxidant Capacity

　　

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是黄酮类化合物的重要来源，但高效提取以及农艺和采后因素对黄酮组成的影响仍未被充分了解。本研究采用响应面法（RSM）优化了紫花苜蓿黄酮的超声辅助双水相萃取（UAATPE），并进一步考察了生长阶段、刈割频率、植株部位和干燥方法对黄酮组成和抗氧化能力的影响。最佳萃取条件为0.54小时、74.77°C和液固比71.31 g/g，与初始条件相比，黄酮产量提高了14%。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定出42种黄酮类化合物，其中紫云英苷（astragalin）、芹菜素（apigenin）和山奈酚（kaempferol）为主要成分。样品类型和处理间存在显著差异：叶片通常比茎和花具有更高的黄酮含量和抗氧化能力；萌芽期比其他生长阶段表现更优；第一次刈割的紫花苜蓿优于后续刈割；热风干燥较其他评估的干燥方法保留了相对较高的黄酮含量和抗氧化能力。总体而言，第一次刈割、萌芽期收获的紫花苜蓿叶片经热风干燥后表现出最佳的整体性能。这些发现为优化紫花苜蓿黄酮的萃取条件以及选择合适的原料和加工方法提供了科学指导。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是黄酮类化合物的重要来源，具有开发功能性食品和营养保健品的潜力。然而，紫花苜蓿黄酮的高效回收仍面临挑战，传统提取方法选择性和效率有限，且以往研究多集中于总黄酮产量，对提取方法、组成特征与抗氧化能力之间的关系缺乏系统理解。此外，生长阶段、刈割频率、植株部位和干燥方法等生物及采后因素对黄酮积累的影响尚未得到全面比较，限制了高价值黄酮原料的合理选择。为此，研究人员开展了本研究，旨在建立高效的超声辅助双水相萃取（UAATPE）工艺，并系统评估这些因素对黄酮含量、组成及抗氧化能力的影响，为紫花苜蓿黄酮的高值化利用提供科学依据。该研究论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，利用超声辅助双水相萃取（UAATPE）结合响应面法（RSM）优化提取条件；其次，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行靶向黄酮代谢组学分析；再次，通过DPPH、ABTS、羟基自由基清除能力（HOSC）和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）四种体外化学法测定抗氧化能力；最后，运用Pearson相关分析和Cytoscape等工具进行统计与可视化分析。样本队列来源于2024年从中国北京一个种植基地（40.18117°N, 116.45085°E）采集的紫花苜蓿（品种WL525）新鲜地上部分，经不同处理后用于后续分析。

研究结果如下：

**3.1 三种提取方法的比较**：通过比较超声辅助甲醇提取（UME）、超声辅助乙醇提取（UEE）和UAATPE，发现UAATPE获得的总黄酮含量（TFC）最高，达7.64 mg/g，较UME和UEE分别提高56.88%和8.52%，这归因于超声破碎与双水相分配协同作用。

**3.2 UAATPE的单因素实验**：筛选了乙醇/（NH₄）₂SO₄体系，确定16%（NH₄）₂SO₄和30%乙醇为最优相组成；超声功率500 W、提取时间1.5 h、温度70 °C、液固比70 g/g为单因素初步最优条件。

**3.3 RSM优化UAATPE条件**：采用中心复合设计（CCD）建立二次多项式模型，模型显著（P<0.001），决定系数R²=0.9984，三因素影响顺序为：提取时间>液固比>温度。最优条件为0.54 h、74.77 °C、液固比71.31 g/g，验证实验得TFC为8.47±0.02 mg/g，与预测值8.51 mg/g吻合良好。

**3.4 LC-MS/MS分析紫花苜蓿黄酮**：靶向分析检出42种黄酮化合物，包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮等，紫云英苷、芹菜素和山奈酚为主要成分。不同处理和部位间黄酮谱存在共同核心，但个体化合物丰度差异显著，糖苷类占比较高，且生长阶段和加工方式影响糖苷与苷元的相对平衡。

**3.5 植株部位对TFC和抗氧化能力的影响**：叶片年均TFC最高（9.14-11.31 mg/g），花在某些时期TFC高但波动大，茎最低。花提取物DPPH和ABTS清除率最高（55.56%和90.13%），叶片羟基自由基清除能力最强（30.78%）。相关性分析表明，抗氧化能力差异与特定黄酮单体（如葛根素、表没食子儿茶素）的丰度相关。

**3.6 生长阶段对TFC和抗氧化能力的影响**：TFC在生长期最高（11.31 mg/g），随发育逐渐下降，至盛花期最低（9.13 mg/g）。抗氧化能力指标因阶段而异：萌芽期DPPH清除率（53.64%）和FRAP最高，盛花期ABTS清除率最高（86.75%）。萌芽期黄酮谱相对均衡，紫云英苷、芹菜素等主要成分含量较高。

**3.7 刈割频率对TFC和抗氧化能力的影响**：第一次刈割TFC最高（8.21 mg/g），随后逐次下降至第四次刈割的3.34 mg/g。抗氧化能力整体下降，但黄酮组成发生重分布：第一次刈割以紫云英苷和山奈酚为主，后续刈割中芹菜素、大豆苷元、木犀草素等含量相对升高。相关性分析显示，不同单体与抗氧化指标存在正负相关。

**3.8 干燥方法对TFC和抗氧化能力的影响**：热风干燥获得最高TFC（10.04 mg/g）和DPPH清除能力（54.26%），真空冷冻干燥保留最高ABTS（90.78%）和HOSC（38.67%），但FRAP最低。自然干燥总体表现最差。黄酮组成差异显著：热风干燥富集紫云英苷和柚皮素，真空冷冻干燥富集芹菜素、山奈酚和木犀草素，自然干燥各化合物水平均较低。

**总结讨论与结论**：研究结果表明，紫花苜蓿黄酮的积累和抗氧化能力受部位、生长阶段、刈割频率和干燥方法的显著影响，且不同处理下的黄酮组成差异是导致抗氧化能力变化的重要原因。结论部分翻译如下：本研究成功建立了高效的紫花苜蓿黄酮UAATPE工艺，在0.54小时、74.77°C、液固比71.31 g/g的最优条件下实现产量8.51 mg/g。通过LC-MS/MS鉴定出42种黄酮化合物。研究人员证实，植株部位、生长阶段、刈割频率和干燥方法显著影响紫花苜蓿的黄酮含量和抗氧化能力。最佳组合为：第一次刈割、萌芽期采收的叶片，并经热风干燥处理。这些发现为紫花苜蓿在功能性食品和营养保健品行业的高值化利用提供了战略框架。