《Journal of Biological Chemistry》：Negative allosteric regulation of Protein arginine methyltransferase 1 (PRMT1) through half-of-sites reactivity
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蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）的活性对于维持正常的真核细胞功能至关重要；然而，其失调与多种人类疾病和癌症的进展有关，使PRMT1成为一个有吸引力的治疗靶点。通过活性位点导向的竞争性策略抑制PRMT1的努力面临重大挑战，凸显了发现和利用别构调控机制的必要
蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）的活性对于维持正常的真核细胞功能至关重要；然而，其失调与多种人类疾病和癌症的进展有关，使PRMT1成为一个有吸引力的治疗靶点。通过活性位点导向的竞争性策略抑制PRMT1的努力面临重大挑战，凸显了发现和利用别构调控机制的必要性。研究人员假设PRMT1二聚化能够实现单个PRMT1亚基之间的通讯，从而调节催化活性。与该想法一致，分子动力学模拟发现，仅当PRMT1二聚体中的单个活性位点被肽底物占据时，化学反应性才具有生产性，表明PRMT1表现出半位点反应性（half-of-sites reactivity）。为了实验验证这一点，研究人员利用二聚体的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）PRMT1（cePRMT1）设计了一个仅具有单个功能性活性位点的PRMT1二聚体模型。体外动力学表征显示，该单活性位点突变体酶表现出野生型酶最大活性的约90%，支持PRMT1具有半位点反应性。此外，天然质谱（native mass spectrometry）表明，cePRMT1二聚体中的半位点反应性由肽底物的负协同结合驱动。总之，这些发现扩展了研究人员对PRMT1寡聚体中亚基间通讯的机制理解，并将半位点反应性确定为一个先前未被识别的调控特征，可用于开发PRMT1选择性别构抑制剂。
蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）是真核细胞中主要的精氨酸甲基转移酶，负责约85%的蛋白质精氨酸甲基化，以S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，催化底物精氨酸残基生成单甲基精氨酸（MMA）和不对称二甲基精氨酸（ADMA）。PRMT1活性对细胞功能至关重要，其失调与心血管、神经退行性、免疫相关及慢性肝病和多种癌症密切相关，因此成为治疗靶点。然而，针对PRMT1活性位点的竞争性抑制剂因PRMT家族活性位点高度保守而难以实现亚型特异性，促使研究者探索别构调控机制。PRMT1以二聚体为最小催化单位，但亚基间通讯是否参与催化调控尚不清楚。本研究旨在通过计算和实验手段揭示PRMT1二聚体中的别构通讯机制。
研究人员结合分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟、蛋白质工程、动力学分析和天然质谱（native mass spectrometry, native MS），发现PRMT1二聚体表现出半位点反应性（half-of-sites reactivity），即仅一个活性位点被底物占据时催化才高效，且该行为由底物负协同结合（negative cooperative binding）驱动。通过构建仅含单个功能性活性位点的秀丽隐杆线虫PRMT1（cePRMT1）异二聚体，证实其活性接近野生型二聚体，并证明单活性位点即可形成ADMA。该研究揭示了PRMT1通过亚基间通讯实现负别构调控的新机制，为设计PRMT1选择性别构抑制剂提供了新策略。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
主要关键技术方法包括：全原子分子动力学模拟（AMBER22，分析近攻击构象）；基于cePRMT1的异二聚体设计与纯化（串联Strep-Tactin和HisTrap亲和层析）；体外甲基转移酶活性测定（MTase-Glo试剂盒，测定表观催化常数k
cat,app）；天然质谱测定底物结合化学计量；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）监测MMA/ADMA产物形成。无样本队列来源。
研究结果如下：
1. 分子动力学模拟识别PRMT1二聚体的不对称性：模拟显示对称二聚体（两个肽和两个SAM）不稳定，一个肽被排出；而不对称二聚体（一个肽、两个SAM）稳定并形成活化的催化几何结构，提示半位点反应性。
2. C. elegans PRMT1模型允许分离具有单个功能性活性位点的PRMT1二聚体：利用cePRMT1的天然二聚体特性，构建了+/+（两个活性亚基）和+/-（一个活性亚基和一个E153A失活亚基）异二聚体，通过串联亲和纯化获得1:1异二聚体，并经天然质谱确认。
3. C. elegans PRMT1异二聚体的动力学分析与半位点反应性一致：动力学测定显示，+/-异二聚体的最大表观k
cat,app约为+/+的81%，校正后约为90%，远超半位点反应性预期的50%上限，支持半位点反应性；使用蛋白底物hnRNPK时，+/-活性约为+/+的97%。
4. cePRMT1沿反应坐标以1:1:2的二聚体:肽底物:辅因子化学计量结合H4(1-21)肽和辅因子：天然质谱表明，无论是否存在SAM，cePRMT1二聚体主要仅结合一个H4(1-21)肽，而可结合两个SAH（S-腺苷高半胱氨酸），表明肽底物结合具有负协同性，驱动半位点反应性。
5. 含有单个功能性活性位点的cePRMT1二聚体可以不对称二甲基化精氨酰残基：LC-MS/MS分析显示，+/-酶能形成ADMA，且与+/+相比，MMA和ADMA的相对比例无显著差异，表明单个活性位点足以完成两轮甲基化。
讨论部分指出，在原子水平上解析PRMT1别构通讯的起源有助于开发新一代抑制剂。本研究的计算模型为研究跨二聚体界面的构象变化、翻译后修饰和癌症相关突变的影响提供了框架。半位点反应性是否在PRMT家族中普遍存在值得进一步探究，该机制可能作为“催化缓冲”保护细胞免受损伤亚基的影响，或通过亚基修饰实现动态调控。
研究结论为：PRMT1二聚体内的亚基间通讯别构调节酶活性，加深了对PRMT1寡聚化调控复杂性的理解，并揭示了一种可利用的微调机制，可用于指导精密的PRMT1抑制剂设计。
