催化环闭合调控根癌菌素生物合成连接酶RhiM与RhiC的底物选择性

《Journal of Biological Chemistry》：Catalytic loop closure governs substrate selectivity in the rhizocticin biosynthetic ligases RhiM and RhiC

　　

RhiM与RhiC是参与抗真菌肽根癌菌素生物合成的ATP依赖L-氨基酸连接酶（Lal）。RhiM催化L-精氨酸与膦氨基酸的连接，RhiC随后将RhiM产物与疏水性氨基酸连接。尽管生化研究已阐明这些连接酶的酶学功能，但由于缺乏核苷酸与底物结合态的结构信息，亦无提议的酰基磷酸中间体的直接结构证据，其催化机制与底物选择性的分子基础尚不明了。本研究对RhiM与RhiC进行了X射线晶体学及生化分析。测定了酶的核苷酸结合态晶体结构，以及RhiC的底物与中间体类似物结合态结构。RhiC结合中间体类似物的结构提供了支持经酰基磷酸中间体进行催化的机制的结构证据。先前报道的RhiM脱辅基（apo）形式与本研究确定的多个反应态结构的比较表明，三个催化环的闭合对于形成底物结合口袋及底物与中间体在活性位点的正确定位至关重要。这些环形成的亲水与疏水口袋被最优配置以容纳RhiM与RhiC底物。突变分析确认参与底物结合与Mg2+配位的残基对连接酶活性有关键作用。这些发现表明催化环的构象重排调控这些酶的催化反应与配体选择性。

研究背景与立项依据

根癌菌素（rhizocticin）是由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633产生的含膦酸抗真菌寡肽，由疏水残基、L-精氨酸（L-Arg）与非蛋白源氨基酸(Z)-L-2-氨基-5-膦基-3-戊烯酸（APPA）组成。其生物合成由rhi基因簇编码的RhiM与RhiC两类ATP依赖L-氨基酸连接酶（Lal）依次催化：RhiM连接L-Arg与APPA，RhiC再连接L-Arg–APPA与疏水性氨基酸（L-Leu、L-Ile或L-Val），且RhiC可延伸生成三肽及以上产物。RhiM与RhiC属ATP-grasp超家族，具A、B、C1、C2结构域特征折叠，其催化机制参照D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶（Ddl）提出的“ATP γ-磷酸转移至第一底物羧基生成酰基磷酸中间体，第二底物氨基亲核进攻形成四面体中间体，释放无机磷酸成肽”模型，但此前Lal领域缺乏底物/核苷酸结合态结构，酰基磷酸中间体无直接结构证据，RhiM仅有的脱辅基结构无法解释底物识别与环构象变化。研究人员旨在解析RhiM/RhiC多反应态结构以阐明催化环闭合、底物选择性及酰基磷酸中间体稳定性机制，论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。

主要关键技术方法

研究人员以枯草芽孢杆菌ATCC 6633（NBRC 3134）基因组为来源克隆rhiM与rhiC，于大肠杆菌BL21(DE3)表达并经Ni-NTA与Superdex200纯化；通过共结晶获得ATP–RhiM、AMPPNP–Leu–RhiC、ADP–LeuPA–RhiC及ADP–RhiC晶体，利用光工厂BL-1A/5A/17A束线收集衍射数据，分子置换（RhiM以PDB 4WD3为模型，RhiC以AlphaFold预测结构为模型）结合Coot/Phenix精修；化学合成不可水解的亮氨酰膦酸类似物LeuPA（(S)-(3-氨基-5-甲基-2-氧代己基)膦酸）模拟酰基磷酸中间体；采用MALDI-TOF MS与串级MS鉴定肽产物，孔雀绿法（malachite green assay）定量无机磷酸释放；以AutoDock Vina对RhiM进行L-Arg对接模拟，并构建RhiM（Q232R、R285A、D376A/L/Y）与RhiC（Y208F/Q、E258A/Q、E271K/Q、R275A）点突变体进行活性验证。

研究结果

晶体结构解析：ATP结合RhiM

共结晶解析ATP–RhiM至2.45 ?，非对称单位二聚体与脱辅基一致。相比apo-RhiM（PDB 4WD3），ATP结合诱导P-loop向活性位点内移，α8螺旋S175 Cα位移4.5 ?，ω-loop（T221–I231）与C-loop（V367–D376）由无序转为有序；Q232氢键桥接ω-loop与C-loop，形成细长亲水口袋识别L-Arg，K151/E193/K194/I196识腺嘌呤，S156/G157/A158识三磷酸，Mg²⁺由E268与ATP α磷酸配位。

RhiC整体配体结合结构

解析AMPPNP–Leu–RhiC（2.90 ?）、ADP–LeuPA–RhiC（3.04 ?）、ADP–RhiC（2.90 ?）。RhiC二聚，具A/B/C1/C2域，C1–C2间长环C302–G322。AMPPNP–Leu–RhiC中AMPPNP、L-Leu、Mg²⁺明确密度；ADP–LeuPA–RhiC结合ADP、LeuPA及两个Mg²⁺；ADP–RhiC中γ磷酸缺失且L-Leu密度弱，三催化环无序。各复合物Cα RMSD小于0.37 ?，主体折叠保守。

RhiC配体识别

AMPPNP–Leu–RhiC中K147/E181/T182/V184识腺嘌呤，K107/K147/S154/G151/G153/R275识磷酸，Mg²⁺由AMPPNP β/γ磷酸及E258/E271配位；L-Leu氨基由Y208/E258识，羧基距AMPPNP γ磷酸3.0 ?并由R275/G278稳，异丁基埋入ω/C-loop构成的疏水口袋。ADP–LeuPA–RhiC中LeuPA磷酸距ADP β磷酸2.9 ?，由S152/G153/E258/E271/Mg²⁺-1配位，额外Mg²⁺-2由E78配位，异丁基占位同L-Leu。

酶活与突变分析

因L-Arg未在RhiM晶体现身，对接示R285/D376参与识别。以L-Arg+L-Ser测RhiM、L-Arg+L-Leu测RhiC（天然APPA缺货）。MS示野生型RhiM产R–S二肽，D376A近野生型释磷，Q232R/R285A/D376L/Y无活性；RhiC野生型产L–R、L–L–R、L–L–L–R，所有突变体（Y208F/Q、E258A/Q、E271K/Q、R275A）及缺Mg²⁺对照均失活，证E258/E271/Mg²⁺配位与Y208/R275底物识别为催化必需。

RhiM与RhiC结构比较

两酶序列同源性56%、一致性20%，Cα RMSD 2.10 ?（258原子）。核苷酸/Mg²⁺（RhiC之Mg²⁺-1）配位残基保守：RhiM E268/E281对应RhiC E258/E271；R285/R275空间等价，突变致死；RhiM口袋底D376负电荷识L-Arg正侧链（D376A活性降非零），RhiC则以ω/C-loop疏水口袋容异丁基，解释其对小侧链疏水氨基酸选择性。

讨论与结论翻译

讨论指出RhiC的A域侧第二位点预成刚性口袋可容L-Arg–APPA及二/三肽延伸底物，硫酸根密度提示APPA膦酸在此相互作用，与体外Val/Leu加至Leu–Arg N端生成三肽的MS/MS证据一致。多反应态结构勾勒出：apo态环柔性→ATP结合环闭合待底物→第一底物就位待磷酸转移→酰基磷酸中间体被闭环稳持（Mg²⁺桥接ADP与中间体磷酸，类BacD四面体类似物PDB 3VMM）→四面体中间体→产物释放后环重无序。该工作确证Lal反应存在酰基磷酸中间体，并提出环运动伴随的底物选择性模型。

结论：基于结构与生化分析，研究人员提出RhiM与RhiC连接机制为——ATP结合诱导三催化环（P-loop、ω-loop、C-loop）装配呈闭合构象并形成底物口袋；保守精氨酸（RhiM R285、RhiC R275）与Mg²⁺及口袋协同定位第一底物，ATP γ磷酸转至其羧基成酰基磷酸中间体；第二底物氨基于A域侧进攻生成四面体中间体，释磷酸成肽；核苷酸/中间体态转换促催化环无序化以解离ADP与产物。本研究验证Lal酰基磷酸中间体存在，揭示环闭合构象重排调控催化与选择性，为酶工程改造底物选择性以合成非天然生物活性肽提供结构基础。