刚地弓形虫PUF家族RNA结合蛋白Puf1与Puf2促进转录本降解

《Journal of Biological Chemistry》：PUF family RNA-binding proteins Puf1 and Puf2 promote transcript degradation in Toxoplasma gondii

　　

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）作为一种高度成功的顶复门寄生虫，主要在快速生命周期阶段转换及适应多样宿主环境过程中依赖转录后机制调控mRNA稳定性与翻译。尽管RNA结合蛋白（RBP）对这些调控过程至关重要，但其在刚地弓形虫生命周期阶段转换及生理胁迫下mRNA翻译、储存与降解中的具体作用仍知之甚少。研究人员鉴定了PUF家族RBP并表征了两个保守成员TgPuf1与TgPuf2，考察了它们在细胞培养与小鼠宿主无性阶段的表达、定位、RNA结合活性、必要性、胁迫响应及转录调控作用。细胞培养基因敲除研究表明，TgPuf1在正常与胁迫条件下均适度支持寄生虫适合度，而TgPuf2基本可缺失。感染Puf1缺失速殖子的小鼠较野生型死亡延迟，但Puf1与Puf2缺失均不影响缓殖子发育。两种TgPuf蛋白均结合保守RNA序列即PUF识别元件（PRE），与核糖核蛋白复合物相关，并与去腺苷酸化酶TgPop2互作。利用合成RNA报告系统，研究人员证明TgPuf蛋白与TgPop2互作后刺激靶RNA聚腺苷酸化尾（poly(A) tail）去除，从而促进RNA降解。双敲除无法获得，利用ΔTgPuf2背景下TgPuf1-mAID可充分说明单个Puf蛋白可缺失，但两者皆无导致严重生长缺陷。综上，这些发现表明PUF蛋白通过去腺苷酸化依赖机制调控刚地弓形虫转录本水平。

研究背景与立项依据：刚地弓形虫属顶复门专性细胞内寄生虫，具有复杂异宿主生命周期（速殖子、缓殖子、孢子化卵囊），在阶段转换与宿主适应中大量依赖转录后调控，尤其是mRNA稳定性与翻译重编程。尽管RNA结合蛋白（RBP，RNA-binding protein）在真核生物转录后调控中地位明确，但顶复虫纲内PUF（Pumilio and fem-3 binding factor）家族成员的数量、必要性及机制长期空白；此前仅知弓形虫TgPuf1具跨物种RNA结合能力，TgPuf2及非经典Puf成员功能未知。鉴于PUF蛋白在动物模型中通过招募Ccr4-Pop2-Not去腺苷酸化复合物降解靶mRNA的范式已建立，研究人员拟系统鉴定弓形虫PUF谱系、界定TgPuf1/2生化特性、体内外必要性及是否经TgPop2介导deadenylation促降解。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，填补了顶复虫PUF机制空白。

主要关键技术方法（≤250字）：基于VEuPathDB的BLASTp同源鉴定与MEGA系统发育构建界定弓形虫4个Puf基因（Puf1、Puf2、Pum3、Nop9）；以RHΔku80与ME49为背景的CRISPR-Cas9单敲除及RH-TIR1Δpuf2中TgPuf1-mAID条件敲低株系；细菌表达TgPuf1/2 RBD（RNA-binding domain）、全长TgPop2及E41A催化突变体；微量热泳动（MST）定量RNA（PRE野生/突变）与蛋白互作；GST pull-down与免疫荧光共定位验证TgPuf–TgPop2结合；AMP-Glo法检测重组TgPop2去腺苷酸化活性；合成Renilla/Firefly荧光素酶报告（含3×PRE WT/mut）转染速殖子定量转录本稳定性；RT-qPCR检测内源PREmRNA；小鼠（BALB/c）感染评估体内毒力与脑囊肿负荷。

研究结果：

T. gondii encodes four Puf proteins：BLASTp鉴定顶复纲普遍含Puf1/Puf2/Pum3/Nop9，弓形虫ME49具TgPuf1（1676 aa，C端Puf域）、TgPuf2（1913 aa，中央Puf域）、TgPum3、TgNop9；AlphaFold2显示经典Puf1/2为8重复新月形，非经典为11重复L/C形，确认两经典成员入选后续功能研究。

Both TgPuf1 and TgPuf2 proteins are expressed during asexual stages and bind to specific RNA sequences：3×myc标记显示两蛋白在速殖子/缓殖子胞质表达，TgPuf1丰度更高；扫描UTR发现146个高置信PRE（UGUA[N]AUA）基因（91%在3'UTR）；MST证实RBD对DmNRE与TgPRE WT亲和~7 nM，PRE两点突变（UGUAUAUA→UCCAUAUA）消除结合，证明序列特异性。

TgPuf1 moderately contributes to tachyzoite fitness, while TgPuf2 is dispensable：RH背景单敲显示Δpuf1复制与噬斑数略降，Δpuf2无影响；入侵/逸出不变；小鼠攻毒（100虫体）Δpuf1死亡延迟至16天（野生/Δpuf2为11天），说明TgPuf1中度贡献体外体内适合度。

Both Puf proteins are dispensable for the bradyzoite stage：ME49背景碱胁迫诱导缓殖子分化，Δpuf1囊肿数略少、Δpuf2不变；感染小鼠50天脑CST1+囊肿数与野生无差，两蛋白对非性阶段缓殖子非必要。

TgPuf proteins exhibit punctate staining and form RNP complexes under stress：PONDR预测两蛋白N/C端高无序；高K+、pH8.5、热激、饥饿下RNA-FISH见胞质由弥散变斑点状（~90%虫体），与PABP、eIF4E1共定位，环己酰亚胺逆转斑点，证实胁迫诱导RNP颗粒组装。

TgPuf1, not TgPuf2, has a role in the survival of tachyzoites under stress conditions：胁迫下Δpuf1入侵率降、TUNEL+达~15%、台盼蓝死率~15%（对照~7%），Δpuf2同野生，表明TgPuf1保胞外胁迫存活。

TgPuf proteins bind to the deadenylase enzyme, TgPop2：STRING预测交集为CCR4家族去腺苷酶TgPop2（TGME49_260240）；GST pull-down与MST（KD 15/26 nM）及IFA（Pearson 0.711/0.811）确认互作；重组TgPop2水解poly(A)₂₀释放AMP，E41A突变失活，证实其Caf1/Pop2 DEDD型催化。

TgPuf proteins stimulate deadenylation activity of TgPop2 and promote the degradation of PRE-containing transcripts：加TgPuf1/2（0–80 nM）增强TgPop2对WT-PRE RNA去腺苷；荧光素酶报告中RHΔku80内RLuc-3×PRE WT/FLuc比降至~10%，Δpuf1/2升至~40%；内源TgGNAT等6个PREmRNA在单敲中积累，证明PUF–Pop2促PRE转录本降解。

TgPuf1 and TgPuf2 double mutant is potentially lethal to the parasite：Δpuf2背景IAA诱导TgPuf1-mAID降解2 h耗尽，虫体复制停滞于2虫体空泡、噬斑极小且不增长，双缺潜在致死，提示功能冗余/互补。

讨论与结论翻译：mRNA翻译调控是即刻而精确的控表达机制，由RBP与UTR元件互作驱动。本研究鉴定弓形虫PUF家族并表征无性阶段TgPuf1/2：TgPuf1缺失中度降低胁迫下复制与存活，TgPuf2敲除无明显表型；两蛋白结合PRE、入胞质RNP、互作TgPop2并调节其去腺苷酸化活性促降解；双敲无法获得提示双缺危及适合度，单敲轻表型可能低估PUF调控全貌。因两蛋白胞质同定位、同序列同亲和，推测功能重叠，类比小鼠Pum1/2双敲致死。顶复虫广含三类Puf，经典TgPuf1/2为8重复新月形，非经典11重复；无性阶段皆非必需，TgPuf1仅胁迫重要，性阶段（猫宿主）或关键——32个PRE基因性阶段表达支持此说，亦与疟原虫Puf配子形成角色呼应。综上，PUF蛋白通过去腺苷酸化依赖机制调控刚地弓形虫转录本水平。