肝细胞生长因子激活剂抑制因子-2 快速失活气道表达的人 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶

《Journal of Biological Chemistry》：Hepatocyte growth factor activator inhibitor-2 rapidly inactivates airway-expressed human Type II Transmembrane Serine Proteases

　　

人II型跨膜丝氨酸蛋白酶（TTSPs）是多种甲型流感病毒和冠状病毒的关键入侵因子，并且在肿瘤细胞过表达时驱动癌症转移。然而，调控这些蛋白酶的天然抑制机制尚不明确。一种天然跨膜蛋白酶抑制剂——肝细胞生长因子激活剂抑制因子-2（HAI-2），已被证实可阻断TMPRSS2活性，并在过表达时能预防SARS-CoV-2感染并减少TMPRSS2驱动的前列腺癌转移。在本研究中，研究人员提供了生化和生物物理证据，表明HAI-2仅在TMPRSS2及其他TTSPs经历酶原激活后才有效使其失活。通过诱变和配体结合实验，研究人员证明Kunitz结构域1（KD1）和KD2可与TMPRSS2及其他TTSPs形成稳定的三元复合物，但并未采用其他大分子丝氨酸蛋白酶抑制剂中典型的Laskowski抑制机制。研究人员还表明，HAI-2蛋白不抑制凝血蛋白酶凝血酶，而多价人IgG标记的HAI-2蛋白是高效的TMPRSS2抑制剂。研究人员的发现为理解TTSP活性在人气道细胞中的调控机制提供了分子基础，并为开发工程化可溶性HAI-2蛋白作为抗TTSP抗病毒药物和抗癌治疗药物奠定了基础。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

人细胞表面蛋白酶在生理和病理过程中发挥关键作用。II型跨膜丝氨酸蛋白酶（TTSPs）是一类细胞表面蛋白酶，其丝氨酸蛋白酶活性参与上皮稳态、呼吸道病毒感染以及癌症侵袭和转移。许多TTSPs已成为人类疾病的重要药物靶点。TTSPs以无活性的前体蛋白（酶原）形式表达，需通过蛋白水解切割完成成熟并激活其S1肽酶（SP）结构域。激活后，TTSPs可切割病毒进入蛋白、肽激素、跨膜生长因子受体等多种底物，直至被天然蛋白酶抑制剂失活或被蛋白水解去除。其中，跨膜蛋白酶丝氨酸-2（TMPRSS2）和TMPRSS11D是驱动人类呼吸道病毒感染的关键因子，它们能快速切割病毒进入蛋白，促进病毒-宿主膜融合，启动感染。

肝细胞生长因子激活剂抑制因子-1（HAI-1）和HAI-2是两种被认为调控TTSP活性的关键蛋白。它们属于I型跨膜蛋白，通过其Kunitz结构域（KDs）抑制包括TMPRSS2在内的多种TTSPs的蛋白水解活性。HAI-1和HAI-2在多种组织广泛表达，在呼吸道和消化道表达略高。HAI-2的表达降低或功能突变与严重先天性腹泻、癌症进展和精子发生障碍相关；而过表达HAI-2足以阻断TMPRSS2驱动的人气道细胞系中SARS-CoV-2的病毒进入。然而，此前关于HAI是否在TTSP酶原激活之前或之后结合以阻断其活性的研究存在矛盾数据。

**研究目的和意义**

本研究旨在探索HAI-2抑制TMPRSS2及其他呼吸道TTSPs蛋白酶活性的分子机制。研究人员利用工程化可溶性HAI-2蛋白，研究其KD1和KD2结构域对酶原形式和活性形式TTSPs的抑制和配体结合效力。通过结合生化和生物物理实验，研究人员证明HAI-2特异性与活性TTSPs相互作用，而非其酶原形式。HAI-2蛋白与呼吸道TTSPs形成稳定的三元复合物，其失活效力与小分子酯萘莫司他相当。此外，HAI-2对呼吸道TTSPs表现出选择性，不抑制凝血酶等其他人胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。在HEK293S细胞中产生的嵌合HAI-2蛋白对TMPRSS2具有显著抑制效力，为未来抗TTSP抗病毒药物和抗癌治疗药物的开发提供了候选分子。该研究为理解TTSP活性在人气道细胞中的调控机制提供了分子基础，并为开发工程化可溶性HAI-2蛋白作为抗病毒和抗癌治疗药物奠定了基础。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用杆状病毒表达载体系统（BEVS）和Sf9昆虫细胞大规模生产可溶性HAI-2 KD1结构域蛋白，并利用Ni²⁺-NTA IMAC和尺寸排阻色谱（SEC）纯化。通过RT-qPCR检测多种细胞系（包括HEK293T、前列腺细胞系、气道细胞系以及人肺和前列腺总RNA）中TMPRSS2、SPINT1（HAI-1）和SPINT2（HAI-2）的mRNA表达水平。使用差示扫描荧光法（DSF）测量配体诱导的TMPRSS2熔解温度（Tm）变化。采用表面等离子体共振（SPR）监测KD1蛋白与TMPRSS2和TMPRSS12的结合与解离。通过酶肽酶活性测定评估抑制效力，并利用反应进程曲线拟合计算失活速率（k_inact/K_I）。此外，还构建了Fc标签融合蛋白，在Expi293F细胞中表达并纯化。

**研究结果**

**HAI-1和HAI-2蛋白的Kunitz结构域1相似但Kunitz结构域2不同**
通过序列比对，研究人员发现HAI-1和HAI-2的KD1结构域高度保守，而KD2结构域在蛋白酶抑制残基上存在显著差异，尤其是P1和P1'位点。HAI-1的KD2结构域含有P1 Lys和P1' Glu残基，已知不能阻断matriptase活性，这提示HAI-2的KD2结构域可能具有不同功能。

**HAI-1和HAI-2与TMPRSS2共表达**
RT-qPCR显示，HAI-1、HAI-2和TMPRSS2在肺组织中均有表达，且在不同气道癌细胞系中表达水平略有差异，证实了它们在肺部的共表达。

**可溶性HAI-2 KD1结构域蛋白快速失活TMPRSS2活性**
纯化的可溶性KD1蛋白以IC₅₀ = (7±3) nM有效抑制重组TMPRSS2（dasTMPRSS2）的活性，与萘莫司他(IC₅₀ = (2.1±0.2) nM)相当。R48A突变体完全丧失抑制能力，表明R48对结合至关重要。通过共加实验和反应进程曲线拟合，KD1的失活效力（k_inact/K_I）为0.21 s^-1μM^-1。

**KD1通过非标准抑制机制失活TMPRSS2**
DSF实验显示，KD1仅诱导活性dasTMPRSS2和催化失活突变体dasTMPRSS2 S441A的Tm显著升高（ΔTms分别为24.8°C和29.4°C），但不对酶原形式的TMPRSS2产生ΔTm。SPR实验表明，KD1与dasTMPRSS2 S441A快速结合且不分离，但与弱抑制的TMPRSS12则快速结合和解离。这些数据表明KD1以非共价方式失活TMPRSS2，不依赖经典Laskowski机制。

**A49突变调节HAI-2 KD1的TMPRSS2抑制机制**
通过系统突变KD1的P1'残基A49，发现仅A49G、A49S、A49T和A49M突变体保留抑制活性，但机制不同。A49G和A49S表现出类似野生型的不可逆失活，而A49T则表现为可逆竞争性抑制（K_i = 196 nM），A49M则逐渐解离。这表明P1'残基对抑制效力和复合物稳定性至关重要。

**KD1 P1'残基影响KD1:TMPRSS2热稳定性**
DSF实验显示，与野生型KD1（ΔTm = 24.8°C）相比，KD1 A49S和A49T的Tm变化较小（分别为10.5°C和7.7°C），与它们较低的复合物热稳定性一致。

**TMPRSS2:KD1复合物对大幅稀释稳定**
SEC实验表明，TMPRSS2与过量KD1共孵育后可在凝胶过滤柱上分离出稳定的TMPRSS2:KD1复合物峰（洗脱体积59 mL），而单独TMPRSS2洗脱体积为71 mL。SDS-PAGE证实该复合物在非还原非热变性条件下稳定存在，分子量约50 kDa。

**HAI-2 KD1非共价失活TMPRSS2的结构模型**
通过结构叠加分析，研究人员利用mesotrypsin:KD1（HAI-2）和HGFA:KD1（HAI-1）的共晶结构，发现KD1的P1-P1'肽键靠近催化丝氨酸，但mesotrypsin的氧阴离子裂隙中Arg255残基延伸至S2'位，而HGFA和TMPRSS2的S2'位由不同残基（T393）占据，这解释了为什么KD1能稳定抑制TMPRSS2和HGFA，而不抑制mesotrypsin。

**分离HAI-2 KD2结构域的蛋白工程和纯化方法**
由于KD2结构域难以重组表达，研究人员设计了带有PreScission蛋白酶切位点的HAI-2胞外域（PreHAI-2），纯化后经酶切释放出未标记的KD1和KD2蛋白，从而获得纯KD2。

**HAI-2 KD2结构域快速失活TMPRSS2**
纯化的eHAI-2、KD1和KD2蛋白均有效抑制TMPRSS2，IC₅₀分别为(3.0±0.8)、(7±3)和(3.9±0.7) nM。反应进程曲线显示它们均使TMPRSS2活性平台化，k_inact/K_I值分别为0.42、0.22和0.22 s^-1μM^-1。DSF显示它们均诱导TMPRSS2大幅Tm升高。这表明HAI-2的KD1和KD2均可独立形成失活三元复合物，不同于HAI-1仅依赖KD1。

**多价HAI-2-IgG融合蛋白是高效的TTSP抑制剂**
研究人员在HEK293S细胞中表达了单体或二聚体Fc标签融合的KD1或eHAI-2蛋白。所有四种嵌合蛋白均有效抑制TMPRSS2，IC₅₀在6-14 nM范围内，其中二聚体(eHAI-2-Fc)₂效力最强（IC₅₀ = 6 nM）。Fc标签蛋白可高产量纯化，且二聚体形式可能通过亲合力增强结合。

**可溶性HAI-2蛋白广泛失活气道TTSPs但不抑制凝血酶**
在100 nM KD1-Fc浓度下，除TMPRSS11B和TMPRSS11E外，所有测试的TTSPs（TMPRSS2/3/13/11A/11D/11F）均被有效抑制。胰蛋白酶被抑制，但凝血酶不被抑制。SARS-CoV-2 S蛋白切割实验进一步证实，KD1和KD2完全阻断TMPRSS2和胰蛋白酶对S蛋白的切割，而萘莫司他抑制凝血酶，KD1/KD2则不抑制。这表明HAI-2蛋白可选择性地靶向气道TTSPs，避免抑制血液中重要的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

**总结与讨论部分**

讨论部分总结了本研究的发现：HAI-2通过独特机制失活TMPRSS2及其他TTSPs，即仅与激活的蛋白酶形成稳定三元复合物，而非与无活性酶原结合。生物物理分析表明，稳定复合物的形成先于且不依赖催化丝氨酸对KD1 P1-P1'可裂解键的亲核攻击。基于此，研究人员提出了一个HAI-2调控气道TTSPs的工作模型：TTSPs沿分泌途径或在质膜上经蛋白水解切割完成酶原激活；激活后切割底物；HAI-2随后以时空控制方式抑制TTSP活性；TTSP-HAI-2复合物最终从细胞表面脱落或进入细胞循环途径。

HAI-2对大多数TTSPs具有广泛活性，但避免抑制凝血酶等其他人胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，这对将其开发为抗TTSP药物策略是有利的特性。研究人员还讨论了之前研究中关于HAI-2结合酶原形式TMPRSS2的争议，指出本研究的生物物理数据不支持此观点，并提出了替代解释（如抑制激活蛋白酶、快速复合物形成与脱落、表位掩蔽等）。

此外，HAI-2的KD1和KD2均可抑制TTSPs，这种双管齐下的抑制特性在生物学上的意义尚不明确。KD1 A49M和A49T突变体可逐渐解离，为设计不同抑制模式的抑制剂提供了新策略。由于多种TTSPs在呼吸道病毒感染中可能功能冗余，泛TTSP干预策略可能比单一靶点更有效。

**研究结论翻译**

本研究的发现为理解TTSP活性在人气道细胞中的调控机制提供了分子基础，并为开发工程化可溶性HAI-2蛋白作为抗TTSP抗病毒药物和抗癌治疗药物奠定了基础。