细胞内口袋和ICL2基序调控NK1受体（TACR1）和NK2受体（TACR2）的G蛋白偶联偏向

《Journal of Biological Chemistry》：Intracellular pocket and ICL2 motifs govern G-protein coupling bias in NK 1 receptor (TACR1) and NK 2 receptor (TACR2)

　　

速激肽受体NK1受体（TACR1）（NK1R）和NK2受体（TACR2）（NK2R）是G蛋白偶联受体（GPCRs），分别优先结合P物质（SP）和神经激肽A（NKA）。尽管这些配体在N端序列上不同，但一个保守的C端基序赋予了部分交叉反应性。在COS-7细胞中，NK1R/SP和NK2R/NKA都在一定程度上激活Gq和Gs信号通路。NK1R/SP显示约三倍的Gs偶联偏好，而NK2R/NKA对Gq和Gs的偶联相当，但整体效力较低。相比之下，NK1R/NKA优先激活Gq，而NK2R/SP表现出可忽略的活性。受体激活使得Gα α⁵-螺旋（称为“波浪钩”）的C端片段插入细胞内受体口袋，涉及细胞内环2（ICL2）。研究人员研究了SP和NKA对NK1R和NK2R差异Gq和Gs偶联的结构基础。结构分析识别出NK1R和NK2R之间位于细胞内口袋底部和ICL2内的四个关键差异。在NK1R和NK2R之间互换基序的逆向突变表明，该区域的改变可以重新定向G蛋白偶联和信号偏倚。

**研究背景与问题**
速激肽受体家族（包括NK1R、NK2R和NK3R）是G蛋白偶联受体（GPCRs），参与多种病理过程（如化疗引起的恶心呕吐、焦虑、哮喘、肥胖等）。尽管NK1R优先结合P物质（SP），NK2R优先结合神经激肽A（NKA），但两者共享保守的C端基序，导致部分交叉反应性。先前研究发现，NK1R/SP对Gs偶联有约三倍偏好，而NK2R/NKA对Gq和Gs偶联相当；但NK1R/NKA优先激活Gq，NK2R/SP几乎无活性。这种配体依赖的偶联偏向的分子机制尚不清楚。冷冻电镜（cryo-EM）结构显示，NK1R与SP结合Gq或Gs时，G蛋白构象高度相似，仅Gq的α⁵-螺旋插入更深，提示偶联偏向可能源于细胞内界面的细微差异。因此，研究人员聚焦于NK1R和NK2R的细胞内口袋及ICL2区域，旨在阐明决定G蛋白偶联偏向的结构基础。

**研究内容与结论**
研究人员通过序列分析、分子动力学（MD）模拟、定点突变及BRET（生物发光共振能量转移）检测（cAMP和IP₃积累）系统研究了ICL2和波浪钩界面模块的作用。结果表明，ICL2的PxxPRL基序（NK1R中PLQPRL）形成构象约束，仅在配体与G蛋白共存时稳定活性构象；波浪钩界面中非保守残基（2.43、6.33、6.36位）通过空间位阻差异调控Gq/Gs选择性。逆向突变（互换NK1R和NK2R对应残基）可重新编程G蛋白偶联偏向。该研究揭示了一个由ICL2和波浪钩界面组成的协同性细胞内信号网络，为理解GPCR偏向信号提供了机制框架。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**关键技术与方法**
1. **分子动力学模拟**：基于冷冻电镜结构（PDB: 7P00、7XWO）构建NK1R和NK2R模型，采用Gromacs/CHARMM36m力场进行>2000 ns模拟，分析ICL2构象动态。
2. **定点突变与逆向突变**：在NK1R和NK2R中互换ICL2和波浪钩界面的关键残基（如L138F、M249T、V246F等）。
3. **BRET信号检测**：在COS-7细胞（ATCC CRL-1651）中，通过CAMYEL传感器实时监测cAMP（Gs通路）和[³H]肌醇标记IP₃积累（Gq通路）。
（注：样本来源为COS-7细胞系，无患者队列。）

**研究结果**
**NKR的ICL2模块**
- **序列分析**：NKRs的ICL2长度为6个残基，含独特PxxP基序（PLQPRL），在A类GPCR中罕见。
- **MD模拟**：仅NK1R/SP/miniGq复合物中ICL2的Pro137、Leu138、Pro140采用受限的Ramachandran构象（α-螺旋/β-折叠），表明ICL2活性构象需要G蛋白稳定。
- **突变实验**：NK1R-L138F突变增强SP和NKA诱导的Gs信号（效力与效能均提升），而Gq信号仅效能增加；NK1R-P137A突变完全失活，证实Pro137对ICL2构象的关键作用。NK2R-F139L突变（等效于L138F）也增强NKA诱导的Gs和Gq信号。

**NKR的波浪钩界面模块**
- **结构比较**：NK1R与NK2R在波浪钩界面的差异残基位于TM2（L71/I72^2.43）、TM6（V246/F248^6.33、M249/T251^6.36）。
- **单点突变**：NK1R-M249^6.36T突变（侧链减小）选择性增强Gq信号（效力与效能），而Gs信号保持；NK2R-F248^6.33V突变（侧链减小）增强Gq信号，但NK2R-T251^6.36M突变抑制Gq。
- **组合突变**：NK1R双突变V246^6.33F/M249^6.36T显著降低Gs信号，而Gq信号减弱较少；加入L71^2.43I后，SP诱导的Gs信号进一步下降（效力降低>10倍），但Gq信号保留。NK2R双突变F248^6.33V/T251^6.36M非预期增强Gs和Gq信号，且加入I72^2.43L后仍增强，表明残基间协同作用。

**ICL2与波浪钩联合模块**
- **NK1R**：联合突变L71^2.43I/L138F/V246^6.33F/M249^6.36T恢复SP诱导的Gs信号效力，并增强Gq信号效力与效能，超过单独突变的效果。
- **NK2R**：联合突变I72^2.43L/F139L/F248^6.33V/T251^6.36M增强Gs信号效能，而Gq信号效力与效能轻微提升，与NK1R模式不同，表明受体特异性协同。

**讨论与结论**
研究总结指出，ICL2与波浪钩界面构成两个协同的细胞内模块，共同控制速激肽受体NK1R和NK2R的G蛋白偶联偏向。ICL2的PxxPRL基序通过构象约束限制G蛋白结合，而波浪钩界面残基（2.43、6.33、6.36）通过空间位阻差异调节Gq/Gs选择性。两者间的非加性效应表明功能协同，且这种协同具有受体特异性，为设计偏向性GPCR药物提供了分子基础。结论部分翻译如下：
本研究鉴定出两个协同的细胞内结构模块，共同控制速激肽受体NK1R和NK2R的G蛋白偶联和信号偏倚。第一个模块由异常短、富含脯氨酸的ICL2组成，其活性态构象受约束，对G蛋白有效结合至关重要。序列分析、分子动力学模拟和突变实验共同表明，保守的PxxPRL基序施加结构限制，形成活性ICL2构象并稳定受体-G蛋白相互作用。这些发现为速激肽受体缺乏固有活性提供了结构解释，因为受体激活需要克服形成活性ICL2构象的能量代价。第二个模块由容纳Gα C端α⁵-螺旋（波浪钩）的细胞内受体表面构成。尽管NK1R和NK2R的整体受体-G蛋白界面高度保守，但逆向突变揭示，2.43、6.33和6.36位的少量非保守残基足以改变G蛋白偶联效率和信号偏倚。特别是，NK1R的6.36位和NK2R的6.33位充当空间微调元件，差异调节Gs和Gq偶联，证明细胞内口袋化学性质的微小变化影响G蛋白亚型选择性。重要的是，ICL2和波浪钩模块并非独立作用，而是通过功能协同产生非加性效应。总之，这些发现确立了速激肽受体中G蛋白选择性由构象受限的ICL2与可调波浪钩界面之间的相互作用所控制，为理解A类GPCR的偏向信号提供了机制框架。