罗望子（Tamarindus indica L.）与黑胡椒籽（Piper nigrum L.）中具推测对香豆酸（p-coumaric acid, p-CA）相关结构特征的黑色素

《Journal of Food Composition and Analysis》：Melanin with putative p-coumaric acid-related structural features from tamarind ( Tamarindus indica L.) and black pepper seeds ( Piper nigrum L.)

　　

本研究探究了从罗望子与黑胡椒籽中分离的黑色素，以阐明其分子组成与结构特征。通过核磁共振（NMR）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行的光谱分析表明，该黑色素主要由芳香单元构成，其质谱特征与对香豆酸（p-CA）衍生结构一致。研究人员对p-CA单体及二聚体进行的密度泛函理论（DFT）计算揭示了多个可能促进结构多样寡聚体组装形成的反应位点。此外，电子顺磁共振（EPR）光谱显示实验g因子与阳离子物种相容，尤其对于含C5-O′C4连接的寡聚模型。这些发现为罗望子与黑胡椒籽黑色素的分子结构及潜在反应性提供了关键见解，支持其在未来功能与应用导向研究中的相关性。

研究背景与立题依据

黑色素（melanin）是一类由酚类氧化聚合形成的高分子量棕黑色生物聚合物，广泛存在于动物与植物外组织中，具有抗氧化、光保护及金属螯合等活性。植物黑色素（phytomelanin）作为多种深色果蔬与种子（葡萄、番茄、黑燕麦、黑胡椒等）的普遍组分，其前体多样，如对香豆酸（p-coumaric acid, p-CA）、表儿茶素等。尽管已有研究提示黑燕麦黑色素含p-CA衍生寡聚结构，但罗望子（Tamarindus indica L.）与黑胡椒籽（Piper nigrum L.）中黑色素的分子骨架、连接模式及顺磁中心性质仍缺乏系统证据。鉴于植物黑色素在食品、化妆品与生物材料中的潜在价值，研究人员开展了针对这两种种子黑色素的提取与多技术结构解析，以明确其是否为p-CA源聚合物，并为后续功能研究奠基。该文发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。

主要关键技术方法

研究人员自沙特阿拉伯利雅得本地零售市场获取罗望子与黑胡椒籽，存于4°C密闭容器。采用2 M NaOH碱溶提取、6 M HCl 110°C酸处理纯化粗黑色素，经水洗与有机溶剂洗涤制得样品。表征端依次使用：紫外-可见光谱（UV–vis）与CIELAB测色判定色素属性；衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）指认官能团；溶液态¹H NMR、¹H-¹H COSY、HSQC及固态¹³C交叉极化魔角旋转（CP/MAS）NMR解析芳香/脂肪/羰基环境；MALDI-TOF MS（正离子线性模式，5–20 kDa）依162 Da间隔推断重复单元；X波段EPR测g因子、线宽ΔHpp、自旋浓度与弛豫；辅以Gaussian 16（B3LYP/6-31G(d,p)）算Fukui指数（CAFI）与分子静电势（MEP），ORCA（B3LYP/EPR-II）算g张量，构建p-CA单体/二聚体及阴/阳离子模型。

研究结果

3.1 表征研究

粗提得率黑胡椒籽0.75±0.5 g/100 g，罗望子0.355±0.2 g/100 g。两样品均不溶于水与多数有机溶剂，溶于浓NaOH、Na₂CO₃与DMSO，耐酸耐氧化。CIELAB中黑胡椒L=14.0更暗，罗望子b=13.0偏黄。UV–vis呈215–220 nm宽吸收向可见区缓降；ATR-FTIR在3000–3600 cm^-1（O–H/N–H）、1602–1707 cm^-1（芳香C=C与醌C=O）、1010–1275 cm^-1（C–O/C–O–C）显示羟基化含氧芳香聚合物特征。

3.2 NMR光谱

罗望子黑色素¹H NMR见芳香与脂肪质子；COSY在δ 7.90/7.02、7.29/6.78等见芳香与烯键耦合，HSQC佐证；黑胡椒因溶解差未获可靠COSY。¹³C CP/MAS中两样品均现10–110 ppm（脂肪）、110–160 ppm（芳香）、160–180 ppm（羰基）近重叠谱，提示结构同源。

3.3 MALDI-TOF MS

两样品均现n=7–18的[(p-CA)_n+H]⁺同系峰，相邻峰差~162 Da，伴+16 Da氧化峰，与p-CA单体164 Da失水缩合一致，支持p-CA重复单元，但研究人员强调异质性下质量间隔非唯一判据。

3.4 EPR光谱

两样品均单对称线无超精细分裂，g≈2.0035；罗望子ΔHpp=0.50 mT略宽于黑胡椒0.45 mT，自旋浓度黑胡椒3.8×10¹⁴ spins mg^-1约为罗望子1.3×10¹⁴的三倍，T₂罗望子13.01 ns较短。表明稳定有机自由基离域于共轭网络，黑胡椒自由基密度更高，罗望子环境更异质。

3.5 DFT分子建模

p-CA中性体CAFI示亲核攻击偏好C_α/C_β与羧基氧，亲电攻击偏好C_β与O_C4；去酚氢后自由基定域于氧中心。MEP示羰基氧负电势、C4酚氢正电势。二聚模型除文献C₅-C′₅、C₅-O′_C4外，C_α/C_β连接振动分析亦可行。g因子计算值：中性自由基~2.0055、阳离子~2.0035、阴离子~2.0030；实验g≈2.0035落于阳离子模型区间，与干样eumelanin碳中心自由基（CCR）g≈2.003而非溶液半醌自由基（SFR）g≈2.005相符。

讨论与结论翻译

讨论指出，碱提酸纯可能微改结构，故结果代表粗提黑色素而非原位原貌；MALDI间隔与NMR耦合共同指向p-CA源，但黑色素异质使单一技术非确证。EPR g因子与阳离子p-CA寡聚（含C₅-O′_C4）相容，然不可断言唯一顺磁种；干/湿样g偏移类比eumelanin中SFR→CCR转变，需更多水合实验验证。

结论部分译文：本结果表明，罗望子与黑胡椒分离黑色素主要由对香豆酸衍生重复单元构成，获MALDI-TOF MS与NMR支持。对代表性p-CA单体/二聚体的DFT计算揭示多反应位点可促进结构多样寡聚架构形成，与植物黑色素固有异质性一致。实验与计算g因子比对显示观测EPR信号与含C₅-O′_C4连接的阳离子p-CA模型相容；然此类归属应视为对顺磁中心的理论诠释而非确定性结构鉴定。结合既往研究，本发现支持黑色素为深色果蔬籽普遍酚聚合物之说，凸显其作为膳食植物化学物之潜要。未来应聚焦主要膳食黑色素酚前体鉴定、分子结构阐明及生物功能（尤与肠道菌群互作及肠健康关联）探究。