整合高通量测序与UFLC-MS/MS探究薏苡仁中真菌多样性与真菌毒素的相关性

《Journal of Food Composition and Analysis》：Integrated high-throughput sequencing and UFLC-MS/MS to explore the correlation between fungal diversity and mycotoxins in Coix seed

　　

本研究采用高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）和超快速液相色谱-串联质谱法（ultra-fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UFLC-MS/MS）探究了薏苡仁（Coix lacryma-jobi L.）中的真菌谱以及真菌毒素与真菌群落之间的关系。结果表明，玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）易于污染薏苡仁。在四组薏苡仁中，仅在室温下贮藏的炒制品中ZEN含量未出现显著波动。炒制过程对真菌群落组成产生了显著影响。此外，环境湿度对炒制薏苡仁真菌群落的影响强于对生品的影响。共有6个真菌属与ZEN和镰刀菌属（Fusarium）呈负相关。这些真菌具有抑菌特性或可能具有降解ZEN的潜力。在室温贮藏的炒制品中，据报道具有ZEN降解潜力且与ZEN含量呈强负相关的米根霉（Rhizopus oryzae）的丰度与其他三组存在显著差异。这可能是未观察到ZEN含量增加的关键原因之一。总体而言，这些结果表明，无论薏苡仁是否经过炒制，包括温度、湿度和水分活度在内的贮藏环境因素都会影响其表面真菌群落的组成以及有害ZEN的含量。

整合高通量测序与UFLC-MS/MS探究薏苡仁真菌多样性与真菌毒素相关性研究解读

一、研究背景与科学问题

真菌是地球上物种最丰富的生物类群之一，广泛分布于食品、植物和环境中。在适宜的温度、湿度和水分活度条件下，产毒真菌能在食品表面繁殖并产生次级代谢产物——真菌毒素，对食品安全和人体健康造成严重危害。全球每年因产毒真菌和真菌毒素污染造成的经济损失超过9.32亿美元，已成为食品工业面临的重大挑战。薏苡仁（Coix lacryma-jobi L.）是我国常用的药食两用资源，富含蛋白质、脂质和淀粉等营养物质，在采收、加工、运输和贮藏过程中极易滋生真菌。其中，玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）是薏苡仁中污染最严重的真菌毒素之一，威胁其质量和安全。然而，以往对薏苡仁真菌群落的研究主要依赖培养法，无法真实反映群落结构和多样性。高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）作为非培养的新一代测序技术，能够同时解析大量DNA分子，具有分辨率高、通量大、成本低等优势，已被广泛应用于微生物群落分析。本研究模拟了常见贮藏条件，系统探究炒制与否、贮藏温度、湿度及水分活度对薏苡仁表面真菌群落和ZEN含量的影响，并揭示真菌多样性与真菌毒素之间的相关性，为有效防控产毒真菌提供科学依据。该研究发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。

二、研究设计与技术方法

研究人员从贵州获取一批薏苡仁，按照《中国药典》麸炒法分为生品（CS）和炒制品（SFCS），分别置于室温（RT）和4℃冰箱中贮藏120天，设置CS_RT、CS_Cold、SFCS_RT、SFCS_Cold四组。每天记录环境温度、相对湿度（relative humidity, RH）和样品水分活度（water activity, a_w）。每15天取样，利用超快速液相色谱-串联质谱法（UFLC-MS/MS）检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A和ZEN；同时基于内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2, ITS₂）进行Illumina MiSeq高通量测序，分析18个样本的真菌群落。生物信息学分析包括OTU聚类、α多样性（Chao1、ACE、Shannon、Simpson）、β多样性（PCoA、PLS-DA）、LEfSe判别分析、基于距离的冗余分析（distance-based redundancy analysis, db-RDA）以及Spearman相关网络分析。

三、研究结果

1. 贮藏条件和样品类型对真菌毒素污染的影响

UFLC-MS/MS检测结果显示，ZEN在所有样品中均有检出，而黄曲霉毒素仅偶然出现。在4℃冷藏条件下，生品和炒制品的ZEN含量在90天后显著增加，生品在75天达到最高值，炒制品在105天达到最高值；在室温条件下，炒制品的ZEN含量保持稳定，而生品在75天后呈波动上升，并在105天达到峰值。当ZEN含量升高时，冷藏样品的a_w值通常高于室温样品，表明低温高湿环境容易导致ZEN积累。

2. 真菌多样性

通过HTS共获得1,273,711条高质量序列，聚类为211个OTU。α多样性分析显示，生品的真菌群落丰度（Chao1和ACE指数）高于炒制品，但炒制品的Shannon和Simpson指数更高，表明炒制降低了丰度却增加了多样性。β多样性分析中，PCoA显示生品和炒制品在PC1（33.54%）和PC2（18.12%）上显著分离（Adonis p<0.005），说明炒制过程显著改变了真菌群落组成。PLS-DA分析进一步表明，室温贮藏的炒制品与冷藏炒制品形成两个明显簇，而生品两组无显著差异，说明贮藏条件对炒制品的真菌群落影响更大。

3. 真菌群落组成

在门水平，子囊菌门（Ascomycota）在生品中占99.39%–99.97%，在炒制品中占59.37%–100%，此外炒制品还检测到毛霉菌门（Mucoromycota）和担子菌门（Basidiomycota）。在纲水平，粪壳菌纲（Sordariomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）和散囊菌纲（Eurotiomycetes）为优势类群。在属水平，生品中镰刀菌属（Fusarium）最丰富（29.40%–69.95%），其次为附球菌属（Epicoccum）、曲霉属（Aspergillus）等；炒制品中除镰刀菌外，还出现毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、平脐蠕孢属（Bipolaris）等。炒制明显改变了真菌群落的组成和相对丰度。

4. 特异性真菌差异

生品与炒制品之间差异显著的属包括Fusarium、Mucor、Rhizopus、Thermoascus、Yarrowia、Byssochlamys、Naganishia、unclassified_o_Saccharomycetales和Botrytis。其中，Fusarium在生品中丰度最高，而Mucor、Rhizopus等在炒制品中相对丰富，表明炒制打破了镰刀菌的优势地位。

5. 不同贮藏环境下的真菌差异

LEfSe多级判别分析（LDA阈值3.5）显示，室温贮藏的炒制品显著富集毛霉菌门、毛霉纲、毛霉目、根霉科、毛霉科、根霉属和毛霉属；4℃贮藏的炒制品显著富集耶氏酵母属（Yarrowia）。db-RDA分析表明，RH和a_w与