评估从褐塘鳢肠道菌群中分离的短小芽孢杆菌HFS2在水产养殖中的应用潜力

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Evaluating the probiotic potential of Bacillus pumilus HFS2 isolated from the gut microbiota of Heteropneustes fossilis for aquaculture applications

　　

背景：益生菌在水产养殖中的应用日益增多，旨在提高鱼类的存活率、生长性能和健康状况，为鱼类养殖提供一种可持续的方法。目的：本研究评估了从褐塘鳢（Heteropneustes fossilis）消化道中分离出的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）HFS2的益生菌特性。方法：在14株分离株中，研究人员通过生理学、生物化学和16S rRNA分析对HFS2进行了表征，并评估了其体外益生菌特性及体内安全性。结果：该分离株为革兰氏阳性、杆状、运动、需氧菌，甲基红、过氧化氢酶和Voges–Proskauer试验呈阳性，吲哚试验呈阴性。该菌株发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇并产酸，但不发酵蔗糖。体外益生菌评估表明，该菌株耐受4–35 ℃的温度范围，在pH 2–5条件下存活，并能耐受2.5–7.5%的胆汁盐浓度。该分离株表现出良好的黏附相关特性，包括自聚集（66%）、细胞表面疏水性（二甲苯69%，甲苯68%），以及与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，53%）和阿尔莱特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae，49%）的共聚集能力。该菌株还对多种鱼类病原体表现出抑制活性，包括格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、简氏气单胞菌（A. jandaei）、维氏气单胞菌（A. veronii）和嗜水气单胞菌（A. hydrophila）。该分离株表现出γ-溶血活性、强生物膜形成能力，并对常用抗生素（包括氨苄西林、万古霉素、红霉素、四环素、氯霉素和环丙沙星）敏感，仅对头孢噻肟表现出耐药性。通过腹腔注射和浸泡攻击（10⁸ CFU/mL）进行的体内安全性评估表明，该菌株对褐塘鳢无致病作用。结论：这些结果表明，短小芽孢杆菌HFS2是一种具有较强耐受性的、有前景的水产养殖益生菌候选菌株。

论文解读：短小芽孢杆菌HFS2的益生菌潜力评估及其在水产养殖中的应用前景

一、研究背景与问题

褐塘鳢（Heteropneustes fossilis），又称刺鲶，是一种营养丰富且在东南亚地区（尤其是孟加拉国）具有重要经济价值的淡水鱼类。其富含铁和钙，且能适应低氧环境，适合集约化养殖。然而，随着水产养殖系统集约化程度的不断提高，传染性疾病日益频发，造成巨大的经济损失。传统上，抗生素被用于控制疾病爆发，但过度和不加选择的使用导致了抗生素耐药性、环境污染和潜在公共卫生风险等问题。因此，迫切需要寻找可持续且环境友好的替代方案，益生菌便是其中之一。益生菌作为活的微生物，适量摄入可为宿主带来健康益处。在 aquaculture 中，有效的益生菌菌株需具备遗传背景清晰、非致病性、能耐受加工储存及胃肠道环境等特性。宿主来源（即自源性）的菌株相较于非原生菌株，通常表现出更优异的肠道黏附能力和功能效果。芽孢杆菌属（Bacillus）成员因其安全性、功能功效和技术适用性，被广泛用作益生菌和生物防治剂。然而，针对褐塘鳢的宿主来源益生菌研究仍相对匮乏。因此，研究人员从健康的褐塘鳢肠道中筛选和表征潜在益生菌，以填补这一研究空白。

二、研究内容与结论

本研究旨在评估从褐塘鳢肠道微生物群中分离出的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）HFS2的益生菌潜力。研究人员从14株肠道分离株中，通过溶血试验和拮抗活性筛选，获得一株具有γ-溶血（无溶血活性）且对多种鱼类病原体具有强抑制作用的菌株HFS2。通过生理生化特征分析和16S rRNA基因测序，该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌，其16S rRNA基因序列与GenBank中短小芽孢杆菌的相似性达99.65%，系统发育分析也支持其分类地位。体外益生菌特性评估显示，HFS2具备良好的自聚集能力（9小时达65.93%）、细胞表面疏水性（二甲苯69.11%，甲苯68.17%）以及与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和阿尔莱特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae）的共聚集能力（分别为53.32%和49.16%），表明其具有潜在的肠道黏附与定植能力。该菌株还表现出强生物膜形成能力，能在pH 2–5的酸性环境、2.5–7.5%的胆汁盐浓度、4–35 ℃的温度范围及1–8%的NaCl浓度下存活和生长，显示出较强的胃肠道和环境应激耐受性。抗生素敏感性试验显示，HFS2对氨苄西林、万古霉素、红霉素、四环素、氯霉素和环丙沙星敏感，仅对头孢噻肟耐药。体内安全性评估通过腹腔注射和浸泡攻击两种方式（剂量为10⁸ CFU/mL）进行，结果显示，在14天（腹腔注射）和30天（浸泡）的观察期内，实验组褐塘鳢均未出现死亡、可见临床异常或内部器官损伤，表明该菌株对宿主无致病性。综合上述结果，研究人员得出结论：短小芽孢杆菌HFS2是一种具有较强耐受性和安全性的、有前景的水产养殖益生菌候选菌株，其多种益生特性有助于改善鱼类健康管理。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：肠道微生物的分离培养（使用营养琼脂培养基，从褐塘鳢中肠分离菌株）；溶血活性测定（筛选非溶血性安全菌株）；琼脂孔扩散法（评估菌株对鱼类病原菌的拮抗活性）；形态学与生化鉴定（包括革兰氏染色、运动性、过氧化氢酶、甲基红、Voges–Proskauer、吲哚试验及糖发酵试验）；分子鉴定（提取基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因并进行Sanger测序，通过BLAST比对和邻接法构建系统发育树）；体外益生菌特性评估（自聚集、共聚集、细胞表面疏水性、生物膜形成、pH/胆汁/温度/盐耐受性测定及抗生素敏感性试验）；体内安全性评价（对褐塘鳢幼鱼进行腹腔注射和浸泡攻击试验）。样本来源为孟加拉国农业大学附近当地鱼市及养殖场。

四、研究结果

1. 肠道微生物分离与初步筛选：从褐塘鳢肠道中共分离出14株细菌，其中8株为γ-溶血，经拮抗活性测试，仅HFS2菌株对格氏乳球菌、豚鼠气单胞菌、简氏气单胞菌、维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌等多种鱼类病原菌表现出显著抑制作用。

2. 生理生化与分子鉴定：HFS2为革兰氏阳性、杆状、运动、需氧菌；过氧化氢酶、甲基红和Voges–Proskauer试验阳性，吲哚阴性；能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇，不发酵蔗糖。16S rRNA基因测序和系统发育分析确认其为短小芽孢杆菌。

3. 黏附特性评估：HFS2的自聚集率随时间增加，9小时达65.93%；细胞表面疏水性在二甲苯和甲苯中分别达69.11%和68.17%；与乳酸乳球菌和阿尔莱特葡萄球菌的共聚集率分别为53.32%和49.16%，显示出良好的定植潜力。

4. 环境耐受性：HFS2在pH 2–5条件下存活，在pH 5时生长最佳；在2.5%胆汁浓度下生长最高；在35 ℃时生长最佳（90.01%）；在2%和4% NaCl浓度下表现出中等生长，显示出较强的胃肠道和环境应激耐受性。

5. 安全性评估：HFS2对大多数测试抗生素敏感，仅对头孢噻肟耐药；无溶血活性；体内攻击试验未发现任何致病效应，证实其安全性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，HFS2的益生菌特性，包括黏附能力、环境耐受性、抑菌活性和安全性，与已报道的其他短小芽孢杆菌和芽孢杆菌属益生菌特性一致。其强自聚集和高疏水性有利于肠道定植和病原菌排斥；pH和胆汁耐受性确保了其能存活并作用于宿主肠道；广谱抗菌活性暗示其可能产生抗菌肽等生物活性物质；抗生素敏感性和无溶血性则支持其安全性。体内安全性试验结果进一步证实了其非致病性。研究结论强调，短小芽孢杆菌HFS2作为一种从褐塘鳢消化道分离的益生菌候选菌株，表现出多种理想的益生特性，有望应用于水产养殖以改善鱼类健康。未来建议在养殖场规模条件下进一步评估其功效和稳定性，以推动实际应用。综上所述，该研究为开发基于宿主来源芽孢杆菌的益生菌制剂提供了科学依据，对水产养殖的可持续发展具有重要意义。