miR-34a和miR-223作为非酒精性脂肪性肝病严重程度的诊断生物标志物

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：miR-34a and miR-223 as diagnostic biomarkers for the severity of non-alcoholic fatty liver disease

　　

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）包括从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及肝纤维化的疾病谱，然而目前的非侵入性工具在区分这些阶段方面缺乏准确性。本研究旨在评估循环miR-34a和miR-223作为NAFLD分期生物标志物的价值。在这项横断面研究中，200名参与者被均分为健康个体以及脂肪变性、NASH和纤维化组。采用茎环逆转录定量PCR（stem-loop RT-qPCR）检测血清miRNA表达，并以miR-16作为内参进行归一化，同时检测临床参数以验证miRNA。组间比较采用方差分析（ANOVA）和Kruskal-Wallis检验，诊断性能通过受试者工作特征（ROC）分析和多变量回归评估。两种miRNA在各疾病分期的平均表达均出现显著变化（p < 0.001）。miR-34a从对照组（1.42倍）升高至NASH组（41.28倍），随后在纤维化组相对下降（12.84倍）；而miR-223在脂肪变性期保持低水平，随后在NASH期急剧升高（42.17倍）。两种miRNA均与ALT、AST、血小板计数和血脂参数强相关（|r| > 0.6，p < 0.01）。联合miRNA panel能准确区分脂肪变性与NASH（AUC = 0.978；灵敏度96%；特异度94%）。两者均与晚期疾病独立相关（miR-34a：OR = 1.32，95% CI：1.18–1.48；miR-223：OR = 1.28，95% CI：1.15–1.42；p < 0.001），处于最高四分位数组的患者风险增加116倍。将两种miRNA加入临床模型后，AUC从0.812提高至0.912（NRI = 0.267，p < 0.001）。miR-34a和miR-223的表达模式为NAFLD分期提供了一种实用的非侵入性方法。

一、研究背景与目的

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种常见的慢性肝病，全球约四分之一人口受累，其疾病谱从单纯性脂肪变性进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），进而发展为肝纤维化，甚至肝硬化和肝衰竭。该研究论文发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。目前临床上准确区分NAFLD各分期仍具有挑战性：肝活检虽是诊断进展性NASH和纤维化的金标准，但存在侵入性、出血风险和取样误差；常规非侵入性指标如丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血小板计数、FIB-4指数和白蛋白等，在敏感性、特异性及分期鉴别能力方面均有明显不足。因此，寻找能够反映NAFLD病理阶段和疾病进展的循环生物标志物具有重要临床意义。研究人员提出，联合评估血清miR-34a和miR-223可能提高对NAFLD不同分期的判别能力。

二、研究设计与主要技术方法

该研究为横断面研究，研究队列来自伊拉克巴格达、巴士拉和摩苏尔的政府医院，于2024年8月至2025年11月纳入200名受试者，均分为健康对照组、单纯脂肪变性组、NASH组和纤维化组，每组50人。脂肪变性依据腹部超声和脂肪肝指数（FLI）≥60诊断；NASH和纤维化依据肝活检组织病理学及NAFLD临床研究网络（NAFLD CRN）评分系统确诊；健康对照无临床、生化及影像学异常。主要关键技术方法包括：血清总RNA提取后采用茎环逆转录定量PCR（stem-loop RT-qPCR）检测miR-34a、miR-223和miR-16，以miR-16为内参，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量；同时检测肝功能、血脂和血小板等临床参数；统计学方法包括ANOVA、Kruskal-Wallis检验、Spearman相关分析、ROC曲线分析、多因素logistic回归、多项logistic回归、四分位分析及Bootstrap内部验证。

三、主要研究结果

3.1 人口学与临床数据
通过ANOVA和卡方检验分析发现，年龄、体重指数（BMI）随疾病严重程度递增，从健康组的30.1±4.2岁增至纤维化组的55.2±9.3岁；ALT和AST在NASH组最高，分别为94.5±8.2 U/L和88.9±7.1 U/L，纤维化组略有下降。血小板计数随疾病进展从289.4×10⁹/L降至135.8×10⁹/L，FIB-4指数从0.89升至4.56。血脂谱也呈显著改变，甘油三酯和总胆固醇在NASH组最高，HDL-C随进展降低，LDL/HDL比值从健康组到NASH组升高后于纤维化组下降。除性别外，所有组间差异均有统计学意义（p < 0.001）。

3.2 miR-34a和miR-223的表达
以miR-16为内参，其Ct值在各组间稳定（p = 0.350，全局变异系数2.36%）。Kruskal-Wallis检验显示两种miRNA表达在各组间差异显著（p < 0.001）。miR-34a在健康组最低（1.42±1.89），脂肪变性组升高至3.85±3.21，NASH组达峰值41.28±32.45，纤维化组相对下降至12.84±18.76。miR-223在健康组和脂肪变性组均较低（1.51±1.78和1.68±1.54），NASH组急剧升高至42.17±33.89，纤维化组下降至26.38±28.92但仍高于健康组。

3.3 各组间miRNA表达两两比较
Dunn检验显示，miR-34a在所有组间两两比较中均有显著差异，其中健康组与NASH组差异最大（Z = 8.91，校正p < 0.001）。miR-223在健康组与脂肪变性组之间无显著差异（Z = 1.24，校正p = 0.645），但健康组与NASH组、脂肪变性组与NASH组差异均极显著（校正p < 0.001）。

3.4 miRNA表达与临床参数的相关性
Spearman相关分析显示，两种miRNA与ALT、AST、总胆固醇、LDL-C及LDL/HDL比值呈强正相关（r > 0.6，p < 0.01），与血小板和HDL-C呈强负相关；与年龄、BMI和甘油三酯呈中等正相关。这表明miRNA水平升高与肝酶升高和血脂代谢紊乱密切相关。

3.5 miRNA作为区分NAFLD分期的诊断标志物
ROC曲线分析显示，miR-34a和miR-223区分脂肪变性与NASH的AUC分别为0.934和0.956，联合模型达到0.978，灵敏度96%，特异度94%。联合模型在区分健康组与任何疾病组（AUC = 0.921）以及纤维化组与其他组（AUC = 0.911）中同样表现最佳。miR-223对纤维化检测的AUC为0.882，miR-34a对NASH与纤维化鉴别的AUC为0.812。Bootstrap内部验证显示乐观度低（0.013–0.021），校正后AUC仍较高，表明模型内部稳定性良好。

3.6 与传统临床标志物的比较
在区分脂肪变性与NASH方面，两种miRNA（AUC > 0.93）显著优于ALT（AUC = 0.821）、AST（AUC = 0.812）、血小板（AUC = 0.712）和FIB-4（AUC = 0.856）。在纤维化检测方面，miR-223（AUC = 0.882）优于miR-34a（AUC = 0.768），且与FIB-4指数（AUC = 0.901）相当（p = 0.412），ALT和AST表现较差。这表明miRNA的诊断准确性优于或等同于传统标志物。

3.7 与晚期疾病独立相关的因素
多因素logistic回归分析显示，miR-34a（校正OR = 1.32，95% CI：1.18–1.48）和miR-223（校正OR = 1.28，95% CI：1.15–1.42）均为晚期肝病（NASH和纤维化）的独立相关因素（p < 0.001）。LDL/HDL比值（校正OR = 1.71）和BMI（校正OR = 1.62）的关联最强，但miRNA在校正年龄、BMI、ALT和血小板后仍保持显著。

3.8 按疾病分组的多项logistic回归分析
以健康对照组为参考，miR-34a与脂肪变性（RRR = 1.28）、NASH（RRR = 2.34）和纤维化（RRR = 1.45）均显著相关；miR-223仅与NASH（RRR = 2.18）和纤维化（RRR = 1.89）显著相关，与脂肪变性无关（p = 0.345）。这提示miR-34a参与疾病早期肝细胞应激，而miR-223更多反映NASH和纤维化阶段的炎症过程。

3.9 基于四分位的晚期肝病风险分级
四分位分析显示，miR-34a最高四分位（Q4）患者晚期疾病比例为88%，相比最低四分位（Q1）风险增加53.67倍；miR-223最高四分位比例为92%，风险增加60.33倍。两种miRNA均处于高四分位（Q3–Q4）时，晚期疾病比例达91%，风险增加116.3倍（95% CI：34.5–392.1），呈现明显的剂量-反应关系。

3.10 诊断模型构建
以年龄、BMI和ALT组成的基线临床模型AUC为0.812。单独加入miR-34a后AUC升至0.878（NRI = 0.184，p = 0.002）；单独加入miR-223后AUC升至0.869（NRI = 0.156，p = 0.008）；同时加入两种miRNA的模型D表现最佳，AUC达0.912，AIC最低（168.4），NRI最高（0.267，p < 0.001）。这表明联合miRNA可显著改善基于临床指标的疾病风险分层。

四、讨论与结论

讨论部分指出，miR-34a在脂肪变性阶段升高与其参与脂质代谢和胰岛素抵抗有关，通过抑制PPARα和SIRT1等脂代谢关键调节因子，促进脂质蓄积和肝细胞凋亡；miR-223在NASH阶段升高则与免疫细胞-肝细胞通讯及中性粒细胞来源的细胞外囊泡介导的炎症调节有关。两种miRNA在纤维化阶段相对下降，可能因功能性肝细胞被细胞外基质替代、产生miRNA的细胞数量减少。miRNA与ALT、AST及血脂指标的相关性支持其反映肝细胞损伤和代谢紊乱。联合模型的高诊断性能与肝脏疾病“多重打击”假说一致，即肝损伤由多种病理过程共同驱动。在临床意义上，miR-34a和miR-223可能补充而非替代现有非侵入性工具，尤其有助于解决FIB-4指数的不确定区间。该研究局限性包括横断面设计、基于单一人群且缺乏外部验证，未来需在多中心、更大规模队列中进行纵向验证。

研究结论为：循环miR-34a和miR-223有望成为诊断和区分NAFLD分期的有效工具。单独来看，miR-34a的表达在早期脂肪变性阶段即升高并贯穿所有疾病阶段，而miR-223在NASH和纤维化阶段升高。两者联合在区分疾病分期方面显著优于常规临床指标（ALT、AST、血小板和FIB-4）。其联合模型的诊断准确性极佳，最高四分位（Q3和Q4）患者发生晚期疾病的风险比最低四分位（Q1和Q2）增加116倍。这一双miRNA panel提供了一种实用的、基于血液的方法，可用于识别晚期肝损伤患者。