《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Development of a potential vaccine against dengue and chikungunya virus co-infection using immunoinformatics and structural evaluation
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登革病毒（DENV）与基孔肯雅病毒（CHIKV）的共感染对两种虫媒病毒共同流行的区域构成日益严峻的挑战，凸显了对整合性疫苗策略的需求。在此，研究人员采用基于免疫信息学的方法，设计了一种针对DENV NS1蛋白和CHIKV NSP1蛋白保守区域的多表位亚单位疫苗
登革病毒（DENV）与基孔肯雅病毒（CHIKV）的共感染对两种虫媒病毒共同流行的区域构成日益严峻的挑战，凸显了对整合性疫苗策略的需求。在此，研究人员采用基于免疫信息学的方法，设计了一种针对DENV NS1蛋白和CHIKV NSP1蛋白保守区域的多表位亚单位疫苗候选物。研究人员根据抗原性、安全性相关筛选和人群覆盖度，选择了保守的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助T淋巴细胞（HTL）和B细胞表位，并通过免疫学上合适的连接子和一个N端人β-防御素-2佐剂进行组装。该构建物经三维建模和验证后，显示出有利的理化特征和可接受的结构质量。对接分析表明其与人Toll样受体4（TLR4）存在稳定相互作用，该相互作用进一步通过简正模式分析和在AMBER v24软件中使用ff19SB力场进行的100纳秒全原子分子动力学模拟进行了验证。轨迹分析支持疫苗-TLR4复合物的构象稳定性，且MM/GBSA计算提示了有利的结合能量学特征。密码子优化支持了在大肠杆菌（E. coli）pET-28a(+)系统中的表达可行性。计算机内免疫模拟进一步预测了体液和细胞免疫反应的诱导，伴随抗体产生增加和免疫记忆的形成。这些结果支持所提出的构建物作为针对DENV-CHIKV共感染疫苗策略的合理候选物，有待进一步的实验评估。
**论文解读：基于免疫信息学与结构评估的登革热与基孔肯雅病毒共感染多表位疫苗设计**
**研究背景与问题**
登革病毒（Dengue virus, DENV）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）均由伊蚊传播，在热带和亚热带地区广泛流行，导致频繁的共感染。这种共感染不仅加剧了临床症状（如关节痛和出血倾向），还使诊断、临床管理和治疗复杂化。全球范围内，DENV-CHIKV共感染的汇总患病率估计为2.5%，在亚洲和拉丁美洲比例更高。然而，目前缺乏针对这两种病毒的特异性抗病毒疗法或联合疫苗。传统的疫苗开发方法面临生产周期长、成本高、安全性问题以及难以应对快速突变或新发病原体的挑战。因此，亟需开发一种能够同时针对DENV和CHIKV的整合性疫苗策略。
**研究内容与结论**
为应对上述挑战，研究人员采用基于免疫信息学和结构评估的框架，合理设计了一种针对DENV和CHIKV共感染的多表位亚单位疫苗候选物。研究从DENV的NS1蛋白和CHIKV的NSP1蛋白中筛选出保守的CTL、HTL和B细胞表位，经抗原性、毒性、致敏性及人群覆盖度评估后，通过合适的连接子（AAY、GPGPG、KK）组装，并在N端融合人β-防御素-2（hBD-2）作为TLR4激动剂佐剂，构建了嵌合多表位亚单位疫苗（CMESV）。通过三维同源建模、分子对接、分子动力学模拟（MD）和MM/GBSA结合自由能计算，研究人员证实该疫苗构建物与TLR4外结构域支架具有稳定的结合和有利的能量学特征。密码子优化和计算机内克隆分析支持其在E. coli pET-28a(+)系统中的表达可行性。计算机内免疫模拟预测了该疫苗能诱导强烈的体液和细胞免疫反应，包括抗体产生增加、免疫记忆形成以及细胞因子（如IFN-γ、IL-12）的升高。该研究发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。
**主要技术方法**
1. **免疫信息学表位预测与筛选**：研究人员利用NetCTL 1.2、IEDB和ABCPred等服务器，从DENV NS1和CHIKV NSP1蛋白的保守区域中预测并筛选出高抗原性、无毒、非致敏的CTL、HTL和B细胞表位。
2. **分子对接与分子动力学模拟**：通过HDOCK服务器进行疫苗构建物与TLR4（PDB ID: 2Z63）的分子对接，随后使用AMBER v24软件（ff19SB力场）进行100纳秒的全原子分子动力学模拟，以评估复合物的构象稳定性和结合动力学。
3. **计算机内克隆与免疫模拟**：使用JCat工具进行密码子优化，评估在E. coli系统中的表达可行性。利用C-ImmSim服务器进行计算机内免疫模拟，预测疫苗诱导的体液和细胞免疫应答。
**研究结果**
**1. 靶蛋白和保守区域的鉴定**
研究人员通过VaxiJen服务器评估了DENV和CHIKV多种蛋白的抗原性，发现DENV的NS1蛋白（抗原性评分0.61）和CHIKV的NSP1蛋白（抗原性评分0.50）得分最高，故被选为疫苗靶标。通过多序列比对，确定了两种蛋白的保守区域，仅将完全保守区域的表位纳入最终疫苗设计，以降低免疫逃逸风险。
**2. 预测表位的鉴定与评估**
* **CTL表位**：利用NetCTL 1.2服务器分别预测出346个（DENV）和527个（CHIKV）CTL表位。经抗原性、毒性和致敏性筛选后，最终从每种病毒蛋白中各选出3个高抗原性、无毒、非致敏的9肽表位（如DENV1的GADIQNTTF、CHIKV的MSDRKYHCV）。
* **HTL表位**：通过IEDB服务器预测出341个（DENV）和1043个（CHIKV）HTL表位。根据最低百分位数排名、抗原性、保守性等参数，最终从每种病毒蛋白中各选出2个HTL表位（如DENV1的EQYKFQADSPKRLSAA、CHIKV的RADVAIYQDVYAVHAP）。
* **B细胞表位**：使用ABCPred服务器预测出26个（DENV）和25个（CHIKV）B细胞表位。经筛选，最终从每种病毒蛋白中各选出3个保守、无毒、非致敏且具有强结合亲和力的B细胞表位（如DENV1的QHNTYRPGYFTQTAGP、CHIKV的GRTQRNTNTMKNYMIP）。
**3. 嵌合多表位亚单位疫苗的构建与结构验证**
研究人员将筛选出的表位用不同连接子（CTL间用AAY，HTL间用GPGPG，B细胞表位间用KK）组装，并通过EAAK连接子将hBD-2佐剂融合至N端，形成由442个氨基酸组成的CMESV。3D结构建模及验证显示，该模型具有高质量（ProSA Z-score为-7.02，ERRAT质量因子为95.85%），且97.0%的氨基酸残基位于Ramachandran图的最适区域。理化性质分析表明该疫苗构建物抗原性强、非致敏、结构稳定（不稳定指数29.50）、亲水性好（GRAVY得分-0.464），分子量为40.81 KDa。
**4. 分子对接与简正模式分析**
研究人员通过HDOCK服务器将CMESV与TLR4外结构域（PDB ID: 2Z63）进行分子对接，预测结合能为-273.27 kcal/mol，表明强亲和力。PDBsum分析鉴定了7个氢键、1个盐桥和307个非键作用，支持稳定的界面形成。iMODS简正模式分析进一步证实了复合物的低变形性和结构稳定性。
**5. 人群覆盖度分析**
利用IEDB人群覆盖度工具分析，MHC-I类限制性T细胞表位预测的全球覆盖度为46%，MHC-II类限制性表位为84%，当两者结合时，总体预测覆盖度提升至93%。
**6. 分子动力学模拟与构象稳定性分析**
通过100纳秒MD模拟，研究人员分析了疫苗-TLR4复合物的稳定性。RMSD值在4-6 ?范围内波动，表明整体构象稳定。RMSF分析显示TLR4核心区域刚性较强，而疫苗构建物的环状区和C端区域柔性较高。回转半径（Rg）稳定在约33.0 ?，表明未发生显著解折叠。天然接触分析识别出多个高占有率（如74.2%的207-889残基对）的稳定界面接触。主成分分析（PCA）揭示了疫苗构建物的局部柔性，而TLR4核心保持稳定。
**7. 结合自由能评估与计算机内克隆**
MM/GBSA计算得出总结合自由能（ΔG_total）为-66.76 kcal/mol，其中范德华力（-172.09 kcal/mol）是主要稳定力。COCOMAPS v2.0界面分析显示，界面面积为2005.95 ?2，包含5个氢键、1个盐桥和36个范德华接触。密码子优化后，该疫苗构建物的密码子适应指数（CAI）为1.00，GC含量为51.30%，表明其在E. coli K12菌株中具有高表达潜力。计算机内克隆将其成功插入pET-28a(+)载体。
**8. 宿主免疫反应的计算机模拟**
C-ImmSim仿真结果显示，接种后抗体滴度（IgM、IgG）显著升高，并在第10天实现抗原完全中和。细胞因子（如IFN-γ、IL-12、TGF-β）水平上升，T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞数量均显著增加，表明诱导了强烈的体液和细胞免疫反应及免疫记忆。
**讨论与结论**
本研究构建的CMESV在计算机分析中展现了良好的免疫原性、稳定性和人群覆盖度。然而，研究人员强调，目前结果仅为预测性，无法完全解决表位加工、免疫优势、交叉反应性及抗体依赖性增强（ADE）等风险。特别是，由于使用TLR4外结构域支架（PDB ID: 2Z63）而非完整的TLR4-MD2复合物，对接和模拟结果应被视为计算机内结构结合稳定性的证据，而非生理性TLR4-MD2激活的直接证明。未来必须通过体外和体内实验，包括抗原表达、免疫原性测定、安全性评估和功效验证，来进一步验证该疫苗候选物的潜力。
**结论翻译**：在本研究中，研究人员利用整合的免疫信息学和结构评估框架，设计了一种针对DENV-CHIKV共感染的合理多表位亚单位疫苗候选物。来自DENV NS1和CHIKV NSP1蛋白的选定保守表位表现出有利的抗原性、可接受的安全性相关特征和广泛的预测人群覆盖度，支持其作为双靶点疫苗设计的适用性。结构建模、分子对接和分子动力学模拟共同表明，所设计的疫苗构建物与选定的TLR4外结构域支架之间存在稳定且能量有利的计算机内相互作用，而免疫模拟提示其具有促进体液和细胞免疫反应的潜力。尽管有这些有前景的计算结果，但研究结果应谨慎解读，因为它们仍处于预测阶段。关键方面如表位加工、免疫优势、潜在的交叉反应性和抗体依赖性增强（ADE）等风险无法完全通过计算机方法解决。因此，需要全面的实验验证，包括体外和体内的免疫原性、安全性和功效评估。这项工作为进一步开发针对虫媒病毒共感染的双靶点疫苗候选物提供了合理的计算基础。
