产核黄素植物乳杆菌B2的双层纳米封装提高胃肠道存活率、黏膜粘附性和结肠炎治疗效果

《Journal of Future Foods》：Bilayer Nanoencapsulation of Riboflavin-Producing Lactobacillus plantarum B2 Improves Gastrointestinal Survival, Mucoadhesion, and Therapeutic Efficacy in Colitis

　　

益生菌的口服给药是预防和缓解结肠炎的一种有前景的策略；然而，其转化潜力常受到以下因素的制约：胃肠道条件下细菌存活率低、黏膜粘附不足、氧化应激以及炎症黏膜部位宿主-微生物相互作用欠佳。为解决这些限制，研究人员开发了一种针对产核黄素植物乳杆菌B₂（*Lactobacillus plantarum* B₂）的双层纳米封装系统，该系统由内层没食子酸（gallic acid）-Ca²⁺金属-多酚网络和外层透明质酸（hyaluronic acid, HA）或牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）涂层组成。通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、Zeta电位和粒径分析以及激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）证实了在细菌表面成功形成了均匀、保形的纳米涂层。在涂覆的配方中，HA涂覆的植物乳杆菌B₂（H-G-植物乳杆菌B₂）表现出显著改善的储存稳定性、增强的模拟胃肠液抵抗力和更高的过氧化氢诱导氧化应激耐受性，同时在豆奶发酵过程中基本保留了细菌生长动力学、产酸能力、核黄素产量和异黄酮生物转化活性。此外，基于HA的纳米封装显著增强了细菌对Caco-2肠道上皮单层的体外粘附性，并延长了小鼠体内的胃肠道滞留时间。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中，口服纳米封装的植物乳杆菌B₂减轻了体重减轻、结肠缩短、组织病理学损伤和结肠氧化应激。机制上，该处理抑制了TNF-α、IL-1β、钙卫蛋白（calprotectin）、髓过氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA）的水平；升高了IL-10、过氧化氢酶（CAT）和还原型谷胱甘肽（GSH）；恢复了紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达；并调节了肠道微生物群组成。这些发现确立了双层纳米封装作为一种有效且生物相容的策略来增强益生菌口服递送，并突出了产核黄素植物乳杆菌B₂作为针对结肠炎管理的微生物组靶向干预手段的治疗潜力。

**论文解读**

**研究背景与问题**
肠道微生物群是维持胃肠道稳态、营养代谢、免疫教育和屏障功能的核心调节因子。菌群失调与溃疡性结肠炎等多种慢性疾病密切相关。炎症性肠病（IBD）全球发病率持续上升，其特点是持续性肠道炎症、上皮屏障破坏、免疫失调和微生物失衡。传统药物干预虽能缓解症状，但常伴有副作用和持久性有限的问题。益生菌疗法因其安全性和恢复微生物与免疫平衡的潜力而成为有前景的辅助或替代方案。然而，口服益生菌在胃肠道中面临严峻挑战：胃酸、消化酶、黏液捕获、短肠停留时间以及炎症条件下升高的活性氧（ROS）会严重损害益生菌的活力和功能活性，从而限制其定植和宿主-微生物相互作用，制约治疗效果。因此，开发简单、生物相容且可适应的表面工程策略以提升益生菌在结肠炎中的存活、粘附和免疫调节性能成为关键。

**研究内容与结论**
为解决上述问题，研究人员针对产核黄素（维生素B₂）的植物乳杆菌B₂（*Lactobacillus plantarum* B₂, CECT 8328, Valencia, Spain）开发了一种双层自组装纳米封装系统。该系统由内层没食子酸（GA）-Ca²⁺金属-多酚网络和外层透明质酸（HA）或牛血清白蛋白（BSA）涂层组成。通过多种表征手段证实了均匀纳米涂层的成功形成。与其他涂层配方相比，HA涂覆的植物乳杆菌B₂（H-G-植物乳杆菌B₂）在储存稳定性、模拟胃肠液耐受性和过氧化氢氧化应激耐受性方面显著提升，同时基本保留了细菌生长、产酸、核黄素产生和豆奶发酵中异黄酮生物转化活性。HA涂层还显著增强了细菌对Caco-2肠上皮单层的体外粘附，并延长了小鼠体内的胃肠道滞留时间。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中，口服纳米封装益生菌减轻了体重减轻、结肠缩短、组织病理损伤和结肠氧化应激。机制上，该处理抑制了促炎因子（TNF-α、IL-1β、钙卫蛋白）、髓过氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA），升高了抗炎因子（IL-10）、过氧化氢酶（CAT）和还原型谷胱甘肽（GSH），恢复了紧密连接蛋白（ZO-1和occludin）表达，并调节了肠道微生物群组成。该研究得出结论：双层纳米封装是一种有效且生物相容的策略，可增强益生菌口服递送，并凸显了产核黄素植物乳杆菌B₂作为微生物组靶向干预手段治疗结肠炎的潜力。论文发表在《Journal of Future Foods》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用双层自组装纳米涂层技术：首先将没食子酸（GA）与Ca²⁺在细菌表面形成金属-多酚网络，再分别涂覆透明质酸（HA）或牛血清白蛋白（BSA）。通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、Zeta电位和粒径分析以及激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）表征涂层。体外粘附实验使用Caco-2细胞单层模型；体内滞留实验使用BALB/c小鼠（8周龄雄性）进行活体成像；结肠炎模型使用C57BL/6小鼠（6周龄雄性）经DSS诱导。

**研究结果**
**3.1 制备与表征植物乳杆菌B₂**：通过TEM、SEM、AFM、Zeta电位和粒径分析以及LSCM证实了双层纳米涂层的成功构建。未处理细菌表面光滑，经GA处理后表面粗糙，BSA涂层引入微突起，HA涂层形成透明外壳。粒径从1.19 μm（未包被）增至1.85 μm（HA涂层）和1.39 μm（BSA涂层）。Zeta电位从-25.07 mV变为-48.37 mV（HA）和-23.53 mV（BSA）。LSCM显示绿色FITC标记的HA/BSA与蓝色Hoechst标记的细菌共定位，证实均匀包被。

**3.2 封装过程中植物乳杆菌B₂的存活率**：所有封装组的存活率均高于89%，其中G-L. P. B2组达92.38%，HA和BSA组分别为91.60%和89.48%，表明封装过程对细菌损伤小。Live/Dead染色显示极少红色死菌。

**3.3 包被植物乳杆菌B₂的模拟胃肠道存活率**：在4°C储存21天后，未包被细菌活菌数从7.85降至4.77 log CFU/mL，而HA和BSA涂层组均维持在约6 log CFU/mL。在25°C储存21天后，未包被组降至1.91 log CFU/mL，涂层组保持在3.12-3.90 log CFU/mL。Live/Dead染色证实纳米涂层显著提高了储存稳定性。

**3.4 包被植物乳杆菌B₂在H₂O₂暴露下的存活率**：经0.5 mM H₂O₂处理2小时后，未包被细菌活菌数从7.85降至4.40 log CFU/mL，而HA和BSA涂层组仅分别降至7.69和7.72 log CFU/mL，表明纳米涂层显著增强抗氧化能力。

**3.5 包被植物乳杆菌B₂在模拟消化过程中的存活能力**：经模拟口腔液（SOF）、胃液（SGF）和肠液（SIF）处理后，未包被细菌活菌数从7.85降至3.39 log CFU/mL，而所有封装组均显示出显著更低的损伤，尤其是双层涂层组。Live/Dead染色证实了存活改善。

**3.6 包被植物乳杆菌B₂的肠道粘附能力**：在Caco-2单层细胞上，HA涂层组（H-G-L. P. B2）的粘附率最高，LSCM显示红色mCherry标记细菌与蓝色Hoechst标记细胞核共定位增加，表明HA涂层促进肠道粘附。

**3.7 包被植物乳杆菌B₂在小鼠模型中的存活能力**：通过活体成像，HA和BSA涂层组在16 h和48 h的荧光信号显著强于未包被组，且48 h后未包被组荧光几乎消失，而涂层组仍可检测，证明纳米涂层延长了胃肠道滞留时间。

**3.8 包被植物乳杆菌B₂的生理特性**：生长曲线显示HA和BSA涂层组与未包被组基本一致，仅G-L. P. B2组延滞期稍长。产酸曲线和豆奶发酵实验中，双层涂层组（HA和BSA）的pH变化与未包被组接近，而单层组（G-L. P. B2）产酸稍慢。核黄素产量：未包被组发酵后核黄素浓度达1.654 μg/mL，HA和BSA组分别为1.464和1.415 μg/mL，均显著高于单层组（1.027 μg/mL）。异黄酮转化方面，HA和BSA组将异黄酮苷转化为苷元的效率与未包被组相当，而单层组转化效率较低。

**3.9 益生菌补充缓解DSS诱导结肠炎小鼠的生理症状**：在DSS结肠炎模型中，HA和BSA涂层组显著减轻了体重减轻、结肠缩短和疾病活动指数（DAI）升高，其中HA组（CH）几乎完全防止了炎症症状。

**3.10 益生菌补充改善结肠炎小鼠的肠道炎症、氧化应激和钙卫蛋白水平**：ELISA和生化分析显示，DSS模型组（CRD）的TNF-α、IL-1β、钙卫蛋白（CALP）、MPO和MDA水平升高，IL-10、CAT和GSH水平降低。HA和BSA涂层组逆转了这些变化，HA组将多项指标恢复至接近正常水平。

**3.11 益生菌补充恢复结肠炎小鼠的结肠屏障功能**：H&E染色显示，模型组出现黏膜变性、坏死、炎症细胞浸润和隐窝丢失，而HA涂层组结肠形态几乎完整。免疫荧光分析显示，模型组紧密连接蛋白ZO-1和occludin荧光强度降低，HA和BSA涂层组显著增加，HA组效果更明显。

**3.12 益生菌对结肠炎小鼠肠道微生物群的预防作用**：16S rRNA基因测序显示，模型组α多样性（Shannon和Simpson指数）降低，PCA和PCoA显示群落结构偏离正常组。益生菌补充逆转了这些变化。在门水平，模型组厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值降低，疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度降低，HA和BSA涂层组逆转了这些趋势。在属水平，模型组未分类的Muribaculaceae和拟杆菌属（*Bacteroides*）丰度降低，而普雷沃氏菌科UCG-001（*Prevotellaceae_UCG-001*）、毛螺菌科NK4A136群（*Lachnospiraceae_NK4A136_group*）和罗姆布茨菌属（*Romboutsia*）丰度升高，益生菌补充显著逆转了这些变化。

**结论部分**
本研究建立了一种稳健的逐层纳米封装方法，以提升植物乳杆菌B₂的口服递送效率和治疗效益。牛血清白蛋白/透明质酸-没食子酸（BSA/HA–GA）双层结构在纳米封装过程中实现了高细菌存活率，并显著改善了益生菌的胃肠道存活。值得注意的是，H-G-植物乳杆菌B₂显著增强了与Caco-2细胞单层的粘附，从而促进了有效的黏膜定植。重要的是，双层结构有效保留了植物乳杆菌B₂的生理功能，包括持续产生核黄素和异黄酮，这对维持肠道氧化还原平衡至关重要。在体内，封装益生菌通过调节宿主免疫反应和重塑肠道微生物群组成发挥了显著的抗炎作用。尽管HA涂层益生菌显示出优越的粘附和滞留能力，但HA和BSA涂层功能差异的机制基础仍有待阐明。在DSS诱导的结肠炎中，该治疗通过协调免疫调节和减轻氧化应激，显著改善了生理参数，恢复了肠道屏障完整性，并减轻了结肠损伤。这些发现表明，BSA/HA–GA纳米涂层有效增强了益生菌的稳定性、胃肠道存活和递送性能，从而提高了封装植物乳杆菌B₂在DSS诱导结肠炎中的治疗效果。研究数据证明了纳米封装植物乳杆菌B₂作为预防或缓解结肠炎的辅助策略的强大潜力，并强调了创新纳米封装技术在针对肠道健康的基于微生物组的营养和治疗干预中具有更广泛的适用性。然而，HA和BSA涂层不同作用的分子机制尚未直接阐明。未来研究应包括黏液结合实验、宿主-微生物相互作用分析以及各层的机制研究，以进一步阐明这些效应的生物学基础。此外，本研究未包含空白载体对照组（无活菌的HA-GA或BSA-GA），因此无法区分涂层材料的独立治疗效果与其载体介导的保护功能，涂层材料和益生菌菌株对观察到的治疗结局的各自贡献有待进一步阐明。因此，益生菌菌株本身和纳米封装策略的相对贡献无法独立量化。未来研究需纳入游离植物乳杆菌B₂对照组，以直接评估纳米封装带来的增量治疗效益。