利用无标记双T-DNA系统在印度尼西亚水稻品种Rojolele中过表达cry1Ab基因以增强其对黄螟（Scirpophaga incertulas）的抗性

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Overexpression of cryIAb gene for enhancing yellow stem borer ( Scirpophaga incertulas) resistance using a marker-free double T-DNA system in Rojolele of Indonesia Rice cultivar

　　

芳香型水稻品种Rojolele（Oryza sativa L. cv. Rojolele）因其优异的感官品质而备受青睐，但对黄螟（Scirpophaga incertulas）高度敏感，该害虫在亚洲地区可造成显著产量损失。为解决这一脆弱性，研究人员开发了一种无标记转基因Rojolele品系，利用双T-DNA载体系统表达cry1Ab基因，从而摆脱对抗抗生素抗性标记的依赖。通过农杆菌（Agrobacterium）介导转化获得21个独立T0代株系，经PCR和Southern blot分析确认至T3代有7个株系稳定整合cry1Ab。免疫试纸条（immunostrip）检测验证了Cry1Ab蛋白的功能性表达，而生物测定显示I.AR.4和III.AR.5.3株系具有完全抗性。易感株系（I.AR.2、III.AR.5.2）表现出转基因素达变异，凸显事件筛选的重要性。无标记策略符合生物安全法规，保留的农艺性状确保与商业栽培的兼容性。本研究为保护高价值芳香水稻提供了可持续方案，将抗虫性与消费者偏好品质结合。未来部署建议开展田间试验及基因叠加等抗性管理策略。

研究背景：水稻是全球半数以上人口的主粮，但黄螟（Scirpophaga incertulas）等单食性鳞翅目害虫通过形成枯心苗和白穗可造成10%至90%的产量损失，在包括印尼在内的亚洲农业生态系统中危害尤甚。传统化学农药管理面临环境污染与抗性快速进化双重风险，常规育种则受限于抗性种质匮乏与遗传模式复杂。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）晶体蛋白（Cry蛋白）可在靶标昆虫碱性中肠经蛋白酶激活后结合钙粘蛋白等受体引发细胞裂解，对非靶标生物安全，已成为转Bt水稻（如表达Cry1Ab、Cry1C、Cry2A）的核心策略。然而商业化Bt水稻多缺乏芳香品质，而印尼热带粳型地方品种Rojolele虽具卓越感官特性却易感螟害，市场亟需兼具抗虫与香米特质的新品系。此外，转基因作物携带抗生素标记基因（如hptII）会引发生物安全疑虑，无标记（marker-free）系统的开发正是为了回应监管与公众接受度挑战。

本研究由印尼国家研究与创新署（BRIN）基因组与作物改良实验室开展，发表于《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。研究人员以Rojolele为受体，构建基于pCAMBIA1300骨架的双T-DNA载体pARBIO：主T-DNA区携ubiquitin启动子驱动之cry1Ab表达盒（nos终止子），次T-DNA区携CaMV 35S启动子驱动之潮霉素磷酸转移酶（hptII）筛选标记；两区以特制含左右边界（LB/RB）适配子插入BstXI/EcoRI位点分隔。经农杆菌Agl-1三亲本杂交导入，转化Rojolele胚性愈伤，潮霉素初筛后再生，获T₀代21个独立事件。

主要关键技术方法（样本队列来源注明）：以印尼Klaten地方香稻Rojolele脱壳种胚诱导胚性愈伤为转化受体；采用双T-DNA共转化策略使cry1Ab与hptII分属两个T-DNA区以实现后续分离；通过T₀至T₃代PCR追踪两基因分离、Southern blot（HindIII消化）确证cry1Ab稳定整合、免疫试纸条检Cry1Ab蛋白、盆栽罩筒人工接黄螟一龄幼虫（每分蘖5头，3分蘖/株）按标准评估系统（SES）0–9级定损；农艺性状以5重复单株测株高、有效分蘖、旗叶、穗长、千粒重等经ANOVA与Tukey检验。

研究结果：

3.1 转化效率与再生：pARBIO转化300块愈伤得37株再生（12.3%），对照pCAMBIA1300为16%，略低但符合爪哇型水稻基因型依赖规律，R3B培养基（IAA:BAP≈1:0.6）支持芽再生。

3.2 分子特征：T₀代21事件均带cry1Ab+hptII；T₂代210株中40.00%仅存cry1Ab（无标记）、26.66%仅hptII、22.38%双带、10.95%双阴，证明两T-DNA未连锁、孟德尔独立分离。T₃代Southern blot均现杂交带（因HindIII切于盒内故不能定拷贝数但证稳定整合），免疫试纸条确证Cry1Ab蛋白表达。

3.3 生物测定与抗性效力：七无标记系中I.AR.4与III.AR.5.3各期损害值D=0（0级，完全抗）；IV.AR.3.1近免（后期微损1级）；I.AR.1、I.AR.3中度（3–5级）；I.AR.2、III.AR.5.2仍感（7–9级），野生型Rojolele亦感（7–9级）。证实位点效应导致蛋白累积量差异决定抗性等级。

3.4 农艺表现：株高、有效分蘖、旗叶长宽、穗长、每穗粒数、千粒重在转株与野生型间无显著差异（p<0.05 Tukey），说明cry1Ab组成型表达未致pleiotropic负效，芳香粳背景特种品质未损。

讨论部分总结：双T-DNA共转化在Rojolele达12.3%再生率虽略低于空载体，但T₂代40%无标记分离率与指示稻、木豆等体系相当；Spacer构型影响连锁整合频率，本研究未测spacer但实践证成独立分离。Southern固定整合位、免疫试纸条证蛋白活性、生物测定分级三者互证方支撑功能抗性结论。抗性变异归因为插入位点positional effect与潜在沉默，故事件筛选不可省。农艺等同性（substantial equivalence）延续cry2AX1无标记稻等前例。无标记剔除hptII缓解环境风险评估阻力，契合“clean gene”潮流；长期抗性需基因叠加（cry1Ab+cry1C/cry2A/vip3A）或Bt+RNAi（如Cry1Ca+dsp38）延阻进化。后续须多环境田间试与挥发物谱检以保香气。

结论部分翻译：本研究成功培育无标记、表达Cry1Ab之Rojolele水稻品系，对黄螟（S. incertulas）具完全抗性。关键成果包括：精准工程——Southern blot分析确认转基因稳定整合于植物基因组，双T-DNA载体策略整合cry1Ab同时剔除hptII筛选标记，获无标记转基因株系；生物安全合规——与全球转基因作物标准对齐。结果为保护芳香水稻提供可持续模型，弥合抗虫性与消费需求。未来推广需田间验证与利益相关方参与以克服监管及公众接受障碍。