《Journal of Biomedical Science》：The ZBTB16/CUL3/ROC1 ubiquitin ligase drives the degradation of pathogenic pendrin (SLC26A4) protein variants
编辑推荐：
背景：编码溶质载体SLC26A4/pendrin的SLC26A4基因中的致病性序列改变可导致Pendred综合征和非综合征型常染色体隐性耳聋B4型（DFNB4），这是全球最常见的两种听力损失形式。由于泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的降解，许多致病性SLC26
背景：编码溶质载体SLC26A4/pendrin的SLC26A4基因中的致病性序列改变可导致Pendred综合征和非综合征型常染色体隐性耳聋B4型（DFNB4），这是全球最常见的两种听力损失形式。由于泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的降解，许多致病性SLC26A4蛋白变体表现出细胞水平降低，而UPS抑制可恢复其质膜表达和离子转运功能。然而，其潜在分子机制仍不清楚，可能涉及与新分子伴侣的相互作用。方法：通过酵母双杂交筛选发现了候选的SLC26A4蛋白伴侣。通过免疫组织化学和小鼠内耳及肾脏中的共定位、内源性和重组蛋白的共免疫沉淀、液相色谱-串联质谱以及荧光共振能量转移研究了该相互作用的生物学意义。结果：研究人员鉴定了含锌指和BTB结构域的蛋白ZBTB16作为SLC26A4的新型相互作用伴侣。ZBTB16与SLC26A4在小鼠耳蜗外沟和螺旋凸起上皮细胞以及远端肾单位非α非β闰细胞顶膜中共定位。研究人员发现ZBTB16是包含支架蛋白Cullin 3和泛素连接酶RocI的泛素连接酶复合物的一部分，并通过其C端锌指区域与SLC26A4 C端硫酸盐转运体和抗Sigma因子拮抗剂（STAS）结构域内的独特氨基酸序列结合。这种直接的分子相互作用导致SLC26A4位点和变体特异性泛素化增加及降解加速。最后，利用基于AI的结构预测，研究人员提供了与实验结果一致的完整SLC26A4/ZBTB16/Cullin 3/RocI复合物的原子模型。结论：这些发现描述了内耳和肾脏中SLC26A4调控以及Pendred综合征和DFNB4耳聋中SLC26A4功能丧失的主要机制，并确定了潜在的新型治疗干预分子靶点。
**论文解读：ZBTB16/CUL3/ROC1泛素连接酶复合物驱动致病性SLC26A4蛋白变体降解的分子机制研究**
**一、研究背景与科学问题**
SLC26家族包含十种溶质载体蛋白，主要作为阴离子交换器，介导氯离子、碳酸氢根、硫酸根、草酸根、甲酸根和碘离子等多种阴离子跨膜转运。SLC26A4（又称pendrin）是该家族中一个重要的氯/碘/碳酸氢根交换器，特异性表达于耳蜗外侧壁特定上皮细胞、血管纹梭形细胞、内淋巴囊和导管中的线粒体丰富细胞，以及球囊、椭圆囊和半规管壶腹嵴感觉器官周围的过渡细胞。此外，SLC26A4在甲状腺滤泡细胞顶膜和肾脏远端肾单位闰细胞顶膜也有显著表达，分别参与碘离子外流以及肾脏碱排泄和氯离子重吸收，对维持酸碱平衡、NaCl平衡和血管容量及血压控制至关重要。
SLC26A4基因的致病性变异可导致非综合征型常染色体隐性耳聋DFNB4或Pendred综合征，二者均以早发性重度至极重度或迟发性波动性进行性听力损失为特征，常伴有内耳畸形（如扩大的前庭导水管伴内淋巴囊和导管扩张），Pendred综合征患者还表现部分碘有机化缺陷及潜在甲状腺功能减退。既往研究表明，多个致病性SLC26A4蛋白变体在异源表达系统中表现出蛋白水平降低，这源于泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的加速降解。研究人员先前已证实，UPS抑制剂（MG132、硼替佐米、卡非佐米和地兰佐米）可增加SLC26A4变体的总蛋白丰度、质膜表达并显著恢复其离子转运活性。然而，将SLC26A4招募至UPS进行降解的精确分子机制仍不清楚，特异性识别SLC26A4的E3泛素连接酶复合物的受体/适配蛋白尚未被鉴定。因此，鉴定这一分子机制中的关键组分对于理解疾病发病机制和开发靶向治疗策略具有重要意义。
**二、研究技术方法概述**
本研究采用了多种关键技术手段：通过酵母双杂交（Y2H）筛选鉴定SLC26A4的候选相互作用蛋白，以小鼠Slc26a4胞内结构域为诱饵筛选成年小鼠肾脏cDNA文库；运用免疫组织化学和共聚焦显微镜验证蛋白在组织中的共定位；通过共免疫沉淀（Co-IP）验证内源性和重组蛋白的分子相互作用；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定泛素化位点；利用荧光共振能量转移（FRET）技术确认直接分子相互作用及空间邻近性；通过半衰期测定和Western blot评估蛋白稳定性；使用碘离子敏感型EYFP变体进行离子转运功能测定；最后利用AlphaFold 3（AF3）进行基于深度学习的多蛋白复合物结构预测。样本来源包括HEK293 Phoenix细胞、HeLa细胞、CBA/J小鼠肾脏及C57BL/6J小鼠耳蜗组织。
**三、主要研究结果**
**Zbtb16是Slc26a4的新型候选相互作用伴侣**：酵母双杂交筛选以小鼠Slc26a4 C末端氨基酸503–780为诱饵，在小鼠肾脏cDNA文库中鉴定出Zbtb16（含锌指和BTB结构域蛋白16），两个独立克隆对应的 prey 片段均覆盖Zbtb16 C末端含有8个C2H2型锌指结构域的区域（氨基酸435–673）。小鼠和人同源蛋白间的高度序列保守性提示该相互作用可能同样存在于人类。
**ZBTB16与SLC26A4在组织中共表达、共定位并发生内源性相互作用**：RT-qPCR显示ZBTB16在新生小鼠血管纹、成年小鼠全耳蜗和全肾以及人甲状腺和全肾中均有转录表达，与SLC26A4的表达组织高度重叠。免疫组化证实Zbtb16与Slc26a4在小鼠耳蜗外沟和螺旋凸起上皮细胞中共定位，并在肾脏远端肾单位非α非β闰细胞顶膜共定位。从小鼠全肾裂解液中以抗Slc26a4抗体进行免疫沉淀，Zbtb16可被共免疫沉淀，证明内源蛋白在天然组织中存在分子相互作用。
**ZBTB16通过其锌指区域与SLC26A4建立直接分子相互作用**：在HEK293 Phoenix细胞中过表达人重组蛋白后，FLAG-SLC26A4与ZBTB16可相互共免疫沉淀。删除ZBTB16锌指区域（ZBTB16 ΔZF，p.C406X）后，其与SLC26A4的相互作用强度显著降低。FRET实验显示ZBTB16与SLC26A4在细胞内区域的FRET效率约为随机FRET水平的四倍，证实二者存在强且直接的分子相互作用，且该相互作用主要发生在细胞内区室而非质膜，提示ZBTB16靶向未成熟形式的SLC26A4。
**ZBTB16与致病性SLC26A4变体的相互作用增强并促进其泛素化**：致病性变体p.L236P和p.R409H与ZBTB16的共免疫沉淀效率显著高于野生型，且ZBTB16表达显著增加了这两个变体的泛素化水平但对野生型无显著影响。FRET实验证实ZBTB16与p.G149R、p.L236P、p.R409H和p.Q413R四种致病性变体均存在显著FRET信号。
**ZBTB16与CUL3和ROC1形成泛素连接酶复合物**：FRET实验证实ZBTB16直接结合CUL3，CUL3直接结合ROC1，而SLC26A4与CUL3或ROC1之间无显著FRET信号，表明ZBTB16作为桥接适配蛋白连接底物SLC26A4与CUL3-ROC1催化核心。共表达四种蛋白后，CUL3、ROC1和ZBTB16可同时从SLC26A4免疫沉淀样品中检测到，证明形成完整的四元复合物。
**ZBTB16/CUL3/ROC1复合物加速SLC26A4变体的降解**：在表达全部降解复合物组分后，SLC26A4 p.L236P和p.R409H的未糖基化形式（100 kDa）蛋白半衰期显著缩短，而糖基化形式（110–130 kDa）未受显著影响，表明该降解复合物优先靶向内质网驻留的未成熟蛋白。功能实验显示，降解复合物共表达使野生型SLC26A4介导的碘离子转运活性降低24%，与蛋白水平下降幅度一致。
**SLC26A4 C末端氨基酸584–673区域是ZBTB16的主要结合位点**：基于蛋白-蛋白相互作用评分分析设计了系列C末端截短突变体，FRET和共免疫沉淀实验一致表明，删除氨基酸584–673区域导致与ZBTB16的相互作用显著减弱。进一步细化截短分析将关键相互作用序列缩小至氨基酸606–641，该区域位于SLC26A4硫酸盐转运体和抗Sigma因子拮抗剂（STAS）结构域的插入序列（IVS）内，富含酸性氨基酸，可能通过静电相互作用与ZBTB16锌指区域富含碱性氨基酸的特性匹配。
**AI结构预测提供了SLC26A4/ZBTB16/CUL3/ROC1复合物的原子模型**：利用AlphaFold 3生成155个预测复合物结构，以实验确定的SLC26A4（残基606–642）和ZBTB16（残基406–673）接触区域为筛选标准，选择同时具有高pTM/ipTM评分和高接触数的最合理模型。该模型显示两个CUL3分子形成二聚体，每个单体分别与ZBTB16和ROC1相互作用，ZBTB16仅与CUL3和SLC26A4接触，SLC26A4与ZBTB16之间存在大量库仑相互作用，ZBTB16主要提供碱性正电荷，SLC26A4提供酸性负电荷。
**ZBTB16/CUL3/ROC1复合物增加SLC26A4 p.R409H变体特定位点的泛素化**：nano LC-MS/MS共鉴定出10个SLC26A4泛素化位点，其中3个（K567、K590、K593）为新型位点。SLC26A4变体表现出额外的变体特异性泛素化位点（p.R409H：K593和K681；p.L236P：K77、K593和K681），且降解复合物显著增加了p.R409H在K590和K593位点的泛素化水平。
**四、总结与讨论**
本研究鉴定出ZBTB16作为SLC26A4的新型相互作用伴侣，其作为CUL3-ROC1泛素连接酶复合物的底物识别适配蛋白，通过C端锌指区域结合SLC26A4 STAS结构域IVS序列中的关键氨基酸区域（606–641），将未成熟/错误折叠的SLC26A4蛋白变体招募至UPS进行泛素化降解。该机制在野生型蛋白中参与生理性周转调控，在致病性变体中则导致过度降解和功能丧失。研究还发现，SLC26A4与ZBTB16的相互作用依赖于锌指区域，且IVS区域富含酸性氨基酸，提示静电相互作用是结合的主要驱动力。基于AF3的原子模型为理解该多蛋白复合物的组装和功能提供了结构基础。这一发现揭示了SLC26A4在内耳和肾脏中调控以及Pendred综合征和DFNB4耳聋中功能丧失的主要机制，靶向ZBTB16结合位点可能为阻止致病性SLC26A4变体的UPS介导降解提供特异性治疗策略。然而，现有证据主要依赖重组蛋白的异源表达，缺乏合适的表达Zbtb16和Slc26a4的内耳细胞模型限制了对体内生物学意义的验证，未来需要组织特异性、急性基因敲除小鼠模型来进一步确证该机制在体内的生理和病理意义。
